[发明专利]一种基于抗性基因及毒力因子基因评价水体健康风险的方法

说明书

本发明提供了一种基于抗性基因及毒力因子基因评价水体健康风险的方法，该方法基于宏基因组测序分析，通过对测序数据的组装和分箱，得到微生物基因组草图，从中识别出潜在的耐药性致病菌(PARB)，并评价样品中潜在PARB的丰度、多样性和风险等级，对PARB含有ARGs和VFGs的数量及类型进行评估，从而确定环境中潜在的PARB的量及健康风险水平。本发明方法基于宏基因组测序，能够在基因组层面上识别出潜在的PARB，且呈现出较高的可信度，避免了传统纯培养法耗时且易受培养条件影响的限制，能够广泛应用于水体健康风险评价。

技术领域

本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种基于抗性基因及毒力因子基因评价水体健康风险的方法。

背景技术

受人类活动的影响，河湖水质逐渐恶化，污染水体对人类带来的健康风险已经引起了越来越多的关注。目前水环境中健康风险评价的一个重要内容是对微生物中病原菌分布的评估。通常用于检测病原菌的方法有纯培养法和基于PCR的分子检测。传统纯培养法耗费时间且易受培养条件的影响，难以应用于大规模生态调查；基于PCR的检测方法则严重受限于扩增目的基因引物的特异性，而很难准确获得病原菌的种类分布。因此，现阶段需要一种新的检测方法用于快速、准确检测环境病原菌的种类及数量。

携带毒力因子基因(VFGs)的细菌作为潜在的病原菌能入侵人或动物而使之患病，而随着抗生素的大量使用，抗生素抗性基因(ARGs)通过基因水平转移等方式转移到病原菌中，由这些含有ARGs的病原菌引起的疾病更难以治疗，因此ARGs及VFGs对于评价环境微生物风险是至关重要的。现阶段已有大量研究旨在通过量化环境中的ARG基因评价水环境中病原微生物的健康风险，然而健康风险水平不仅仅依赖于ARG的数量，更与其遗传背景相关。当ARGs与VFGs共存于生物染色体、质粒等遗传因子中时，其对人类及动物的潜在风险将会上升。基因组中同时携带了ARGs和VFGs的潜在的耐药性致病菌(PARB)，既存在潜在的致病风险，且能在一定程度上降低抗生素的治疗效果。因此，相比于抗生素耐药菌，PARB更合适作为一项评价水环境中微生物健康风险的指标。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明将提供一种基于抗性基因(ARGs)及毒力因子基因(VFGs)评价水体健康风险的方法，通过对水体样品的宏基因组测序，识别出样品中潜在的PARB，并对PARB含有的ARGs和VFGs的数量及类型进行分析，从而评价水体健康风险水平。

为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：该方法基于宏基因组测序分析，通过对测序数据的组装和分箱，得到微生物基因组草图，从中识别出潜在的耐药性致病菌(PARB)，并评价样品中潜在PARB的丰度、多样性和风险等级，对PARB含有的ARGs和VFGs的数量及类型进行评估，从而确定环境中潜在的PARB的量及健康风险水平。

本发明技术方案进一步详述，所述方法包括如下步骤：

(1)采集水体样品，提取获得样品的宏基因组测序数据，并对原始测序数据(rawreads)进行质量过滤，得到高质量读段(clean reads)；

(2)对每个样品获得的clean reads进行组装，获得重叠群(contigs)；

(3)根据contigs的核酸组成和丰度变化模式，对序列进行聚类、分箱，得到微生物基因组草图(metagenomic assembled genomes,MAGs)，对所有的MAGs根据完整度和污染率进行评估，选择出符合要求的高质量代表性MAGs，对高质量代表性MAGs进行去冗余，获得非冗余MAGs集；

(4)对所述非冗余MAGs集的所有contigs预测开放阅读框(ORF)，对所有ORF依次与抗生素抗性基因数据库和毒力因子数据库比对，识别出同时含有ARG序列和VFG序列的MAGs即定义为潜在的PARB，并统计这些潜在的PARB携带ARG和VFG的种类及数量；