[发明专利]一种高效促进纤维环源干细胞增殖的方法

说明书

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶三维培养法和生物力学作用高效促进纤维环源干细胞增殖的方法。本发明所述高效促进纤维环源干细胞增殖的方法，以Collagel凝胶支架作为三维基质，通过将纤维环源干细胞与Collagel凝胶混合为细胞悬液进行培养，形成模拟体内生长环境的三维结构微环境，同时联合生理性的动态压力作用，模拟体内椎间盘纤维环组织承载的动态压力作用，促进体外培养的纤维环源干细胞增殖。

技术领域

本发明属于生物技术及细胞培养技术领域，具体涉及一种基于Collagel凝胶三维培养法和生物力学作用高效促进纤维环源干细胞增殖的方法。

背景技术

椎间盘退变是一种常见疾病，尤其是随着人口老龄化和人们工作生活方式的改变，椎间盘突出、椎管狭窄等脊柱退行性疾病的发生率不断升高，部分症状严重患者甚至需要接受手术治疗。目前，髓核摘除和椎间融合是脊柱退行性疾病的主要手术疗法，但术中却不可避免地会造成纤维环的缺损。

纤维环是指位于椎间盘的周缘部、由纤维软骨组成的纤维组织，纤维环的纤维在椎体间斜行，并在横切面上排列成同心环状，相邻环的纤维具有相反的斜度，而相互交叉。纤维环的前方有坚强的前纵韧带，前纵韧带的深层纤维并不与纤维环的浅层纤维融合在一起，却十分加强纤维环的力量；而纤维环的后方有后纵韧带，并与之融合在一起，后纵韧带虽较前纵韧带为弱，亦加强纤维环后部的坚固性。简言之，纤维环在吸收震荡和保持髓核组织形态上发挥了重要作用。纤维环的损坏会导致椎间盘不再处于密闭环境，而椎间盘压力降低等一系列微环境改变均不利于椎间盘的修复和再生，术后长时间很可能会出现邻近节段退变、继发性脊柱不稳等一系列问题。因此，纤维环的完整性对限制髓核的突出及维持椎间盘的功能尤为重要。纤维环源干细胞具有向纤维环不同原始细胞的能力，利用组织工程技术重建纤维环结构可能成为比较理想的治疗方式。

研究表示，在体外建立模拟体内的三维生长环境，并给予纤维环源干细胞生理性动态压力作用，对于体外培养的纤维环源干细胞具有更好的促进增殖及作用，尤其是体外建立适合细胞生长的生理微环境对纤维环源干细胞行为及生理功能具有重要影响。目前，体外纤维环源干细胞的培养主要分为普通培养法和三维培养法两大类别，其中，普通培养法由于缺少三维结构支撑，培养的纤维环源干细胞处于贴壁状态，无论是在形态、结果和功能方面都与体内自然生理环境生长的细胞想去甚远，给予动态压力作用时，难以实现细胞全方位受力而出现受力不均的情况，不利于纤维环源干细胞在椎间盘组织修复和纤维环组织再生中的应用，以及医学组织工程学的研究。

三维细胞培养技术(three-dimensionalcell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养技术可提供类似体内生长环境的三维支架或基质，模拟细胞生长的体内生理环境，形成三维生长架构，促进细胞建立起细胞间及细胞与细胞外基质的联系，促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动。目前，纤维环源干细胞的三维培养法主要包括海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝胶及Matrigel凝胶法。其中，海藻酸钙凝胶法虽然操作时条件温和，对活细胞损伤小，但固定后却存在机械强度不高的缺陷；琼脂糖凝胶虽具有较大的空隙，允许大分子物质自由扩散，却更适合培养悬浮细胞；Matrigel凝胶法存在步骤复杂、成本较高的缺陷，并且无法在生理环境的不同生物力学状态下保持长时间的高度凝胶状态，导致三维基质结构容易破坏，培养的纤维环源干细胞粘附能力较差，从而失去三维结构的支撑，细胞与细胞或细胞外基质的相互作用减弱，影响到细胞的生长功能，不利于模拟体内生理性生物力学环境下，纤维环源干细胞生长的研究。

另外，由于纤维环组织本身具有一定的强度和弹性，这对于维持椎间盘组织的生理功能、保持脊柱运动时的稳定性具有重要的作用，而且，由于体内生理环境下或脊柱运动过程中，与中央的髓核组织相比，位于外周的纤维环组织承受更多的拉伸应力，也使得一般状态下的三维培养方式对于纤维环源干细胞的增殖，并非是最理想的培养方试。

发明内容