[发明专利]以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质及其应用

说明书

本发明公开了一种以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质及其应用。以亲水性多孔微球为层析基质，层析基质中依次加入二甲基亚砜和烯丙基溴进行活化；活化的层析基质与N‑溴代丁二酰亚胺反应，进行溴代醇化；将溴代醇化后的层析基质偶联氨基苯(磺)酰胺吡啶配基；最后采用乙醇胺水溶液对未反应的溴代醇化末端进行封闭，得到以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能基团的混合模式层析介质。本发明的新型层析介质可结合IgG型广谱抗体分子，具有抗体吸附容量大、选择性高、非盐依赖吸附的特性，通过改变溶液pH至弱酸性即可实现解吸和回收，制备过程简便，价格低廉，可以用于层析分离广谱的IgG型抗体，包括血液中多克隆抗体和细胞表达的单克隆抗体药物。

技术领域

本发明涉及一种以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质及其应用，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。

背景技术

抗体产品往往纯度要求较高，同时还必须保持生物活性，因此传统的分离过程往往难以满足要求。蛋白A或蛋白G亲和层析介质能够特异性结合抗体的保守区域，具有广谱的抗体分离能力，但蛋白类亲和配基易被料液中蛋白酶降解脱落，重复使用次数低，洗脱较困难，介质价格昂贵，使用成本极高，限制了规模化应用。传统的离子交换层析和疏水相互作用层析等方法虽然能够结合抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，纯化效果有限。因此，开发具有抗体保守区域结合选择性的非蛋白类配基很重要。

目前报道的针对抗体分离的非蛋白配基较多，有仿生亲和配基Ligand 22/8(J.Chromatogr. B 2000，740：1)、多肽配基TG19318(J.Mol.Recognit.1998，11：128)、D2AAG(J.Chromatogr. A 2012，1225：158)和HWRGWV(J.Chromatogr.A 2009，1216：910)等。这些配基往往过于关注特异性和亲和力，造成抗体洗脱条件较为苛刻或者收率较低。混合模式层析是一种新型的生物分离技术，配基兼有多种功能基团，可以与目标蛋白产生疏水和静电等多种相互作用。混合模式介质的配基密度通常较高，吸附容量大，具有耐盐吸附特性，洗脱条件温和，特别适合于大规模的分离纯化，已在抗体等蛋白的分离纯化中得到应用。专利US 8,129,508 B2 和AU 2012351751B2利用以巯乙基吡啶为配基的混合模式介质MEP HyperCel，从细胞培养液中分重组蛋白或者抗体。专利US 20050272917A1利用MEPHyperCel从人或牛血浆中分离免疫球蛋白G，纯化得到IgG可用于研究、诊断或疾病治疗等领域。专利CN 101284224B、专利CN101279244B、CN101279243B、CN104096544B分别公开了以巯乙基吡啶、巯甲基咪唑、巯基苯并咪唑、氨基苯并咪唑为配基的吸附介质及其制备方法。Luo等(J.Chromatogr.A, 2018,1533:77)采用填充有ABI-4FF和MMI-4FF介质的两步层析，分离血清中IgM，但是少量HSA也会结合到层析介质，影响分离抗体的纯度。Wang等(J.Chromatogr.B,2013,936: 33)采用混合模式介质Bestarose Diamond MMA、BestaroseDiamond MMC、MEP HyperCel 和PPA HyperCel介质从模拟血清中分离IgG，其中BestaroseDiamond MMA介质同时吸附IgG 和HSA，吸附选择性差；Bestarose Diamond MMC和PPAHyperCel介质存在抗体洗脱困难，不利于实际分离应用；MEP HyperCel介质主要吸附IgG，但仍结合少量HSA，IgG的选择性一般。因此，开发性能更优良的混合模式介质，对于抗体的大规模分离纯化有着重要的意义。

混合模式层析的关键是特殊设计的、组合多种相互作用的功能配基，针对广谱的IgG型抗体分离，筛选吡啶类、咪唑类、吲哚类和多芳香环类等小分子化合物配基库，进行了配基和IgG亲和性表征，发现氨基苯磺酰胺吡啶和氨基苯酰胺吡啶类化合物可结合于IgG分子的保守区域，对IgG亲和性高、选择性强、耐盐性好，是潜在的、具有广谱抗体分离能力的新型混合模式配基。

发明内容

本发明的目的是提供一种以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质及其应用。