[发明专利]一种近岸海水中弧菌的检测方法

说明书

本发明公开了一种近岸海水中弧菌的检测方法，包括如下步骤：1)针对弧菌特有基因设计上、下游引物；对阳性对照弧菌进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳检测，将呈现的目的条带切胶回收，进行测序；2)构建标准质粒模板；3)建立Q‑PCR定量标准曲线：4)环境样品测定：本发明的方法，缩短了检测时间，由原方法的10‑12天，缩短为1天，在完成标准曲线的情况下仅需3‑4个小时，其次，克服了现有方法无法测定不可培养性弧菌的问题，提高了鉴别的准确度。

技术领域

本发明涉及常见菌检测技术领域，特别涉及近岸海水中弧菌的检测方法。

背景技术

弧菌(Vibrio.spp)是一种革兰阴性嗜盐菌，主要存在于近海岸的海水、海水沉积物和鱼虾、贝类等海产品中。一方面，食用被弧菌污染的海产品会导致急性肠胃炎、反应性关节炎等疾病，严重时甚至能引起败血症。另一方面，弧菌能够导致扇贝、虾等水产养殖产品患病，引发养殖病害。目前，选择性培养方法检测弧菌耗时长，人力物力消耗大。因此，亟需一种高效率、短时间就可检测到不可培养的弧菌数量的检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效率、检测时间短的近岸海水中弧菌的检测方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种近岸海水中弧菌的检测方法，包括如下步骤：

1)针对弧菌特有基因设计SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；对阳性对照弧菌进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将呈现的目的条带切胶回收，进行测序；

2)构建标准质粒模板：

将步骤1)切胶回收的DNA片段与PGM-T载体连接后导入大肠杆菌，增菌培养后涂布于含有浓度为50μg/ml氨苄青霉素的LB选择平板上过夜培养；用无菌牙签随机挑取单菌落，在含有浓度为50μg/ml氨苄青霉素的LB液体选择培养基中震荡培养2h，以菌液为模板，以SEQ ID NO.1所示的上游引物和和SEQ ID NO.2所示的下游引物进行PCR筛选阳性克隆，以1％的琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆，将阳性克隆对应的菌液，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体选择培养液中过夜培养，提取质粒测序；

3)建立Q-PCR定量标准曲线：

将步骤2)获得的质粒用核酸含量测定仪测出质粒的浓度，并用在线计算软件：http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html计算出质粒模板的准确拷贝数，用双蒸水进行10倍梯度稀释，以稀释后的质粒模板DNA水溶液为模板，建立反应体系：2×SYBR Green QPCRMix 5μL、双蒸水3.5μL、浓度为10μM上游引物0.25μL、浓度为10μM下游引物0.25μL、模板1μL；在Q-PCR仪上运行Q-PCR的程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；以反应完成后Q-PCR仪读取的Ct值和模板水溶液拷贝数的对数值建立标准曲线；

4)环境样品测定：

提取环境样品DNA，以环境样品DNA为模板，建立反应体系：2×SYBR Green QPCRMix 5μL、双蒸水3.5μL、浓度为10μM上游引物0.25μL、浓度为10μM下游引物0.25μL、模板1μL；在Q-PCR仪上运行Q-PCR的程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；以反应完成后Q-PCR仪读取的Ct值，代入标准曲线，计算环境样品中弧菌浓度。

本发明的优点：

与现有的基于选择性培养法检测相比，本发明的方法，缩短了检测时间，由原方法的10-12天，缩短为1天，在完成标准曲线的情况下仅需3-4个小时，其次，克服了现有方法无法测定不可培养性弧菌的问题，提高了鉴别的准确度。

附图说明