[发明专利]一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法

权利要求书

1.一种基于体外肿瘤细胞培养模型的灵芝质量评价方法，所述方法包括：

(1)取待测灵芝样品，用溶剂配制成样品溶液；

(2)取阳性对照品，用溶剂配制成阳性对照品溶液；

(3)构建肿瘤细胞的2D或3D培养模型，用培养液将样品溶液和阳性对照品溶液稀释成不同浓度，与肿瘤细胞共孵育；

(4)分别吸除步骤(3)孵育后的溶液，加入新鲜的培养液，再加入细胞活力指示剂反应1～5h，采用酶联免疫检测仪检测反应液的吸光度或荧光强度，计算灵芝样品溶液、阳性对照品溶液对肿瘤细胞增殖的抑制率，并计算相应的IC50，以细胞增殖抑制率评价灵芝质量；所述细胞增殖抑制率的计算方法为：

细胞增殖抑制率(％)＝[1-(OD_{样品组或阳性对照组}-OD_空白组/OD_{空白对照组}-OD_空白组)]×100％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)取待测灵芝样品，用溶剂配制成样品溶液；

(2)取阳性对照品，用溶剂配制成阳性对照品溶液；

(3)构建肿瘤细胞的2D或3D培养模型，用培养液将样品溶液和阳性对照品溶液稀释成不同浓度，分别与肿瘤细胞共孵育；

(4)构建肿瘤细胞的3D培养模型，将培养液稀释后的样品溶液与对照品溶液混合，所得混合溶液与肿瘤细胞共孵育；

(5)分别吸除步骤(3)、(4)孵育后的溶液，加入新鲜的培养液，再加入细胞活力指示剂反应1～5h，采用酶联免疫检测仪检测反应液的吸光度或荧光强度，计算灵芝样品溶液、阳性对照品溶液和混合溶液对肿瘤细胞增殖的抑制率，并计算相应的IC50或增殖抑制率，以细胞增殖抑制率或增长抑制率评价灵芝质量；所述细胞增殖抑制率的计算方法为：

细胞增殖抑制率(％)＝[1-(OD_{样品组或阳性对照组}-OD_空白组/OD_{空白对照组}-OD_空白组)]×100％

增长抑制率(％)＝抑制率_混合溶液-抑制率_{阳性对照品溶液}。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为下列之一：肝癌细胞，乳腺癌细胞，结肠癌细胞，肺癌细胞，胃癌细胞，或胰腺癌细胞；所述阳性对照品为下列之一：氟尿嘧啶，顺铂，伊立替康，或多西紫杉醇；所述步骤(4)混合溶液中灵芝样品的浓度为0.001～10mg/mL。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述细胞活力指示剂为下列之一：吖啶橙/溴化乙锭，DAPI，Hoechst，MTT，XTT，SRB，MTS，CCK-8，CTG，或Calcein/PI。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述细胞活力指示剂为CCK-8，反应时间为3.5h，细胞增殖抑制率(％)＝[1-(OD_{样品组或阳性对照组}-OD_培养基/OD_{空白对照组}-OD_培养基)]×100％。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述细胞活力指示剂为MTT，反应时间为4h，细胞增殖抑制率(％)＝[1-(OD_{样品组或阳性对照组}-OD_{二甲基亚砜}/OD_{空白对照组}-OD_{二甲基亚砜})]×100％。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述2D培养的肿瘤细胞由如下方法获得：肿瘤细胞用胰酶消化后，用培养基稀释、重悬肿瘤细胞，混匀获得细胞悬液，将细胞悬液等体积均匀分散在微孔板中，获得肿瘤细胞2D培养模型。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述3D培养的肿瘤细胞由如下方法获得：肿瘤细胞用胰酶消化后，用培养基稀释、重悬肿瘤细胞，混匀获得细胞悬液，取基质材料溶解，等体积均匀分散在微孔板中，待基质材料成胶后，将细胞悬液等体积均匀分散在微孔板中，获得肿瘤细胞3D培养模型。