[发明专利]一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法

权利要求书

1.一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备人多发性骨髓瘤细胞裂解物；

2)从多发性骨髓瘤患者外周血分离DC，并利用Ad-NK4转染；

3)利用步骤1)的人多发性骨髓瘤细胞裂解物致敏步骤2)转染后的DC。

2.根据权利要求1所述的一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于，步骤1)包括以下步骤：收集U266细胞，1000rpm离心5min，PBS重悬；液氮冷冻1min，而后在37℃环境下融解，重复3次；5000rpm离心10min，收集上清，经0.22μm孔径滤器过滤并收集，检测其中蛋白浓度。

3.根据权利要求2所述的一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于，步骤2)包括以下步骤：取多发性骨髓瘤患者的外周血，获取外周血单个核细胞PBMNCs，采用CD14磁珠分选收获的PNMNCs；收获的CD14⁺的PBMNCs，用终浓度100ng/ml的rhGM-CSF和终浓度50ng/ml的rhIL-4诱导分化为DCs；以Ad-NK4转染DCs。

4.根据权利要求3所述的一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于，步骤3)包括以下步骤：在DC培养的第6天，室温下融解U266细胞裂解产物，根据所测蛋白浓度加入蛋白溶液，至终浓度为100μg/ml，以致敏不同处理组诱导培养的DC，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育12h；收集促成熟的DC，1000rpm离心5min，即得到Ad-NK4修饰的DC疫苗。

5.根据权利要求2所述的一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于步骤1)中，在液氮冷冻前，对重悬液中的细胞进行计数。

6.根据权利要求2所述的一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于步骤1)中，在液氮冷冻过程中，重悬液容纳于冻存管中，每管1.5ml。

7.根据权利要求2所述的一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于步骤1)中，所述在37℃环境下融解，是在37℃的水浴箱中实现的。

8.根据权利要求2所述的一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于步骤1)中，对蛋白浓度的检测是利用BCA蛋白质浓度检测试剂盒实现的。

9.根据权利要求3所述的一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于步骤2)中，外周血单个核细胞PBMNCs是利用密度梯度离心法获得的。

10.根据权利要求4所述的一种Ad-NK4修饰的DC疫苗构建方法，其特征在于，还包括以下步骤4)：取步骤3)所得的Ad-NK4修饰的DC疫苗，加入PBS溶解后，吹打均匀、计数，送流式进行鉴定。