[发明专利]一种基于基因/蛋白作为胆道闭锁诊断标志与治疗靶点的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于基因/蛋白作为胆道闭锁诊断标志与治疗靶点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

选取肝动脉主干和肝内汇管区小动脉进行观察，其中，肝动脉主干结构及功能指标通过多普勒超声测量和吲哚菁绿血管造影方法，肝脏汇管区小动脉结构借助组织学测量；

研究人类胆道闭锁模型与动物胆道闭锁模型肝脏中Notch的表达，检测方法采用了RT-PCR、Western-blots、OPAL多光谱染色以及小鼠肝门部血管平滑肌细胞原代培养与染色；

在动物胆道闭锁模型中针对Notch3进行多样化干预，在动物胆道闭锁模型中进行Notch3的过表达与抑制实验进行验证。

2.根据权利要求1所述的一种基于基因/蛋白作为胆道闭锁诊断标志与治疗靶点的方法，其特征在于，所述通过多普勒超声测量和吲哚菁绿血管造影方法检测肝动脉主干结构及功能指标，具体为：

临床多普勒超声检测肝动脉主干结构及功能指标：将病理性黄疸患儿分为BA组与非BA胆汁淤积组，记录病例基本资料、超声测量肝动脉直径、门静脉直径、肝动脉阻力指数及肝动脉加速时间，将超声测量肝动脉直径、门静脉直径测量选择肝右动脉近端与门脉平行的截面作为解剖标志，在确认捕捉到稳定的肝动脉脉冲信号后读取血流动力参数；

吲哚菁绿血管造影检测肝动脉主干结构及功能指标：病例选择为高度怀疑BA需要行腹腔镜胆道造影检查的患儿，设置组别为BA组和年龄匹配的Non-BA组，ICG从静脉推注后经体循环从肝动脉入肝显影，反映肝动脉对器官的灌流情况，使用0.9％NaCl注射液配制溶液，将腹腔镜图像采集系统调到荧光模式，调节镜头将视野中心集中于肝脏，从静脉通道快速推注结束时立即开始计时，维持镜头稳定观察荧光强度变化并采集动态影像。

3.根据权利要求1所述的一种基于基因/蛋白作为胆道闭锁诊断标志与治疗靶点的方法，其特征在于，肝脏汇管区小动脉结构的组织学测量具体为：借助石蜡组织切片的HE染色及α-SMA免疫组化染色后进行小动脉结构测量，随机选择200或400倍视野下管壁由2～5层平滑肌细胞构成的微动脉，内径(ID)测量选取最大横径和最小横径长度取均值，管壁厚度(AW)测量选择均匀间隔的3处管壁，以最大横径和最小横径连线交点为中心测量厚度取均值，记录AW/ID比值。

4.根据权利要求1所述的一种基于基因/蛋白作为胆道闭锁诊断标志与治疗靶点的方法，其特征在于，所述研究人类胆道闭锁模型与动物胆道闭锁模型肝脏中Notch的表达，采用RT-PCR检测人体肝脏或者小鼠肝脏组织中Notch1-4，及其下游靶基因Hes1、Hes5、Hey1、Hey2、HeyL；

采用Western-blot检测用来对比人体肝脏Notch3-Hey1通路蛋白表达和小鼠Notch3、HIF-1α、VEGFA蛋白的动态表达趋势。

5.根据权利要求4所述的一种基于基因/蛋白作为胆道闭锁诊断标志与治疗靶点的方法，其特征在于：所述采用RT-PCR检测人体肝脏或者小鼠肝脏组织中Notch1-4，及其下游靶基因Hes1、Hes5、Hey1、Hey2、HeyL，其中，人源引物序列如下：

鼠源引物序列如下：

6.根据权利要求1所述的一种基于基因/蛋白作为胆道闭锁诊断标志与治疗靶点的方法，其特征在于，所述研究人类胆道闭锁模型与动物胆道闭锁模型肝脏中Notch的表达中，采用OPAL多光谱染色的抗体/荧光配色方案为：Notch3/蓝绿，Hey1/灰色，HIF-1α/黄色，Vimentin/洋红，SMMHC/正红，CK19/绿色，PADI/蓝色。

7.根据权利要求1所述的一种基于基因/蛋白作为胆道闭锁诊断标志与治疗靶点的方法，其特征在于：所述小鼠肝门部血管平滑肌细胞原代培养与染色，具体方法为，选择出生Day10～Day14小鼠解剖肝门部血管分离VSMCs，观察对比BA小鼠与正常小鼠肝门部VSMCs形态与表型特征。