[发明专利]一种天麻葡糖基转移酶基因及应用

说明书

本发明公开了一种天麻葡糖基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；本发明根据天麻转录组提供的CDS序列筛选出葡糖基转移酶基因序列，并设计巢式PCR的引物通过扩增拼接得到葡糖基转移酶基因全长序列；构建原核表达载体pGEX4T‑UGT，表达纯化获得蛋白，构建真核表达载体对UGT基因的表达进行亚细胞定位，将构建的真核表达载体pH2GW7.0‑35S‑UGT通过农杆菌侵染法将葡糖基转移酶转入单核蜜环菌菌丝中获得转基因蜜环菌，使用其生物合成天麻素，以期用转基因蜜环菌人工栽培天麻，增加天麻中天麻素含量，同时也可以通过培养基因工程蜜环菌生产天麻素。

技术领域

本发明属于分子生物学和植物基因工程领域，具体涉及一种天麻天麻葡糖基转移酶基因以及将该基因转入到单核蜜环菌中，通过生物合成的方法将4-羟基苯甲醇转化为天麻素。

背景技术

天麻是一种名贵中药材，以前主要依赖于野生资源，但是野生天麻资源总量少，远远不能满足人们对它的需求。20世纪60年代开始人工栽培天麻，并且随着人们对天麻生活习性研究越来越多，人工栽培天麻的技术不断提高，但是人工栽培天麻仍面临生长周期长，受外界环境影响大等多方面因素使得天麻仍然满足不了人们的需求。天麻素是天麻的主要成分，天麻素有巨大的药用价值，常用的获取天麻素的方法有化学合成法，植物提取法和生物合成三种方法。植物提取法是人们最早使用的提取方法，用这种方法提取出来的天麻素更天然健康，无毒副作用，但是植物提取成本高，工作量大，提取效率低，且因为天麻由种子生长成为商品麻箭麻大概需要三年半时间而造成原料严重供应不足问题。为了满足人们对天麻素的需求,人们开始通过合成的方法来获取天麻素。

周俊等人于1979年首次从中药天麻中分离得到一个新化合物，经鉴定为4-羟甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为天麻素。并于次年采用红磷和溴素等原材料化学合成了天麻素，总产率达24%。几年后，有研究者将合成工艺改进，将总产率提高到31.80%。但是用这种方法获得天麻素的过程中产生很多有害气体。为了降低对环境的危害，戴晓畅于2004年采用三溴化磷代红磷和溴素，这在一定程度改善了对环境的危害。后来，有人以五乙酰-β-D-葡萄糖和对甲酚为原料，经糖苷化反应和自由基卤代反应等反应化学合成天麻素。王多平于2014年用对羟基苯甲醇代替对羟基苯甲醛，优化了上述加工过程得到天麻素。但是整体而言人们不能从根本上彻底解决化学合成天麻素过程中产生的危害环境的气体等物质。

为了减少对环境的危害并获得高质量的天麻素，人们开始研究用生物合成的方法获得天麻素。近年来，微生物已被设计制造出一系列经济上重要的天然产物，如皂苷类物质三萜皂苷、类黄酮类物质、生物碱等。同时也早已有人研究用生物合成法合成酚类化合物天麻素。2005年，蔡洁等利用转基因人参毛状根将外源物质对羟基苯甲醇转化为天麻素，对羟基苯甲醇在经过24h转化后转化率达到百分之八十以上；2006年，朱宏莉用华根霉将对羟基苯甲醛转化为天麻素；后来有人用白花曼陀罗细胞或者紫花曼陀罗毛状根悬浮培养转化外源对羟基苯甲醛合成天麻素；2016年，Bai等利用药用植物红景天(Rhodiolarosea)来源的尿苷二磷酸葡糖基转移酶和诺卡氏菌(Nocardiaiowensis)来源的羧酸还原酶在大肠杆菌中构建了天麻素合成途径；2018年，钟贝芬通过整合谷氨酸棒状杆菌来源的cre基因簇中部分基因和红景天来源的糖基转移酶基因ugt (UGT73B6FS编码基因)，构建以4-甲酚为原料生产天麻素的重组大肠杆菌。

生物合成法是近年来的研究热点，用该方法合成天麻素等物质弥补了化学合成法污染环境的缺点，它对环境友好，原材料利用率高且整个过程耗时短，很多研究者利用该方法合成了各种各样的次生代谢产物，表明该方法具有可行性。

目前未见与本发明技术方案相关的文献报道。

发明内容