[发明专利]一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法

说明书

本发明公开了一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，属于生物工程技术领域。本发明公开的一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，通过敲除巴斯德毕赤酵母GS115中糖酵解关键基因pgi和肌醇生物合成负调节基因PAS_chr‑1_0033，同时过表达肌醇‑3‑磷酸合成酶(ino1)基因，提出了一种利用巴斯德毕赤酵母GS115表达肌醇的新方法。本发明首次以巴斯德毕赤酵母为表达宿主，实现了毕赤酵母表达肌醇的实用技术，采用高密度发酵培养的方法，最终工程菌在5L发酵罐中肌醇产量可达32.3g/L。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体的说是涉及一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法。

背景技术

环已六醇中肌醇最被人所熟识，因存在于肌肉组织中而得名。肌醇具有广泛的用途，在饲料工业中作为生物促进剂可促进牲畜生长和防止死亡，在食品工业中作为营养强化剂可防止脂肪在人体内特别是心血管内沉积。

目前，中国生产肌醇的主要原料仍为农产品加工过程中的副产物，如玉米和米糠等的浸渍液。为了减少能耗和污染，利用生物法制备肌醇越来越受到研究者的重视，主要包括微生物酶催化法和微生物发酵法。发酵法主要以混合糖类为原料，以酵母菌、大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌为主要生产菌经发酵分泌肌醇到发酵液中，再经对发酵液处理，浓缩结晶制得高纯度的肌醇。

大规模生产中大肠杆菌易受到噬菌体的污染，枯草芽孢杆菌难以达到较高的菌体密度，因此酵母菌是最适合工业化发酵生产肌醇的菌株。利用酵母菌生产肌醇是建立在对其肌醇代谢途径的理论研究基础之上的。1976年报道了分泌肌醇的酵母菌S.cerevisiaes(ino+)的肌醇生物合成的控制。1981年发现S.cerevisiaes中至少存在3个基因位点对肌醇的生物合成关键酶的合成起着阻遏作用。1990年利用基因工程技术得到肌醇生物合成的负调节因子opi1基因缺陷并多拷贝INO1基因的酿酒酵母YS2，提供了利用基因工程制备肌醇的方法，但YS2摇瓶水平肌醇产量仅为1.021g/L。

巴斯德毕赤酵母是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，已经成功表达了近700种外源蛋白，48h时其菌体生物量(OD₆₀₀)可达395。因此，提供一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，进一步提高肌醇产量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)以巴斯德毕赤酵母GS115为出发菌株，敲除糖酵解关键基因pgi，获得敲除pgi基因的菌株△pgi-GS115；

(2)敲除菌株△pgi-GS115的肌醇生物合成负调节基因PAS_chr-1_0033，获得敲除PAS_chr-1_0033基因的菌株△PAS_chr-1_0033△pgi-GS115；

(3)在菌株△PAS_chr-1_0033△pgi-GS115中过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1，构建产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌△PAS_chr-1_0033△pgi-GS115(ino+)。

进一步，一株产肌醇的巴斯德毕赤酵母工程菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)PCR扩增zeocin基因及pgi基因上下游400bp序列；

(2)利用重叠PCR将上述3个基因片段连接，获得序列zeocin-UD；

(3)将序列zeocin-UD通过电转化转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，筛选获得敲除了pgi基因的工程菌△pgi-GS115；