[发明专利]用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针及其制备方法和用途

权利要求书

1.用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针，其特征在于，结构如下：

2.如权利要求1所述的用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和/或单线态氧的双功能荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1、称取4-(二乙氨基)水杨醛并将其溶于无水乙醇中，接着加入丙二酸二乙酯，搅拌均匀，再加入哌啶，得到混合液A，将混合液A加热回流搅拌；反应结束后冷却至室温，去除多余的溶剂，在冰水浴条件下，依次加入等量的乙酸和盐酸，然后继续加热回流搅拌反应；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调节pH，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素；

步骤2、首先用等量的三氯氧磷和DMF制备威尔斯试剂，再用DMF将步骤1得到的7-(二乙氨基)香豆素完全溶解，然后将其滴加到制备好的威尔斯试剂中，得到混合液B，加热回流搅拌反应；反应结束后，将反应后的混合液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调节pH，将沉淀物减压抽滤得滤饼，再用无水乙醇重结晶，得7-(二乙氨基)香豆素醛；

步骤3、首先将4-(二乙胺基)水杨醛、乙酰乙酸乙酯和哌啶用甲醇溶解，在室温下，让混合物充分搅拌反应；等反应结束后，通过过滤收集得到橙色滤饼，然后在无水乙醇中重结晶纯化得到橙色固体A；

步骤4、首先将步骤2得到的7-(二乙氨基)香豆素醛和步骤3得到的橙色固体A溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，再加入四氢吡咯，然后在室温下搅拌反应；反应结束后，去除多余溶剂，用柱层析法对所得反应后产物进行纯化，得到红色固体B；

步骤5、在氮气保护下，将1，2-二溴乙烷和三苯基膦溶解在甲苯溶液中，充分搅拌后加热回流；反应结束，将其冷却至室温，过滤，得到白色固体C；

步骤6、在氮气保护下，将步骤5得到的白色固体C和硫代乙酸钾溶解在水和乙醇的混合溶剂中，置于室温下搅拌反应；反应结束之后，向混合溶液中加入水并充分混合，然后用二氯甲烷萃取，收集有机相，除去溶剂，得到白色固体D；

步骤7、在氮气保护下，将步骤6中得到的白色固体D溶解在甲醇中，加入盐酸，并将所得的混合物加热回流搅拌反应；反应结束之后，将水加入到混合物中并充分混合；用二氯甲烷萃取，收集有机相；减压蒸馏除去溶剂得到白色固体，然后在无水乙醇中重结晶进一步纯化得到了产物E；

步骤8、将步骤4得到的红色固体B和步骤7得到的产物E完全溶解在三氯甲烷中，在油浴中加热回流搅拌；反应结束后，通过柱层析法进一步纯化得到固体，即得到了用于检测细胞线粒体内次氯酸根离子和单线态氧的双功能荧光探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，

步骤1中，所述4-(二乙氨基)水杨醛、无水乙醇、丙二酸二乙酯、哌啶、乙酸和盐酸的用量比为6g～8g：40mL～60mL：8mL～12mL：1mL～2mL：30mL～40mL：30mL～40mL；所述第一次加热回流搅拌反应的温度为100～105℃，时间为6～7h，所述第二次加热回流搅拌反应的温度为85～95℃，时间为11～12h，所述重结晶用的温度为90℃；

步骤2中，所述三氯氧磷、7-(二乙氨基)香豆素的用量比为10mL～12mL：4g～6g；所述加热回流搅拌反应的温度为85～95℃，时间为11～12h，所述重结晶用的温度为90℃；

步骤1和步骤2中，用氢氧化钠溶液调节pH时，均为将pH调至5。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述4-(二乙氨基)水杨醛、乙酰乙酸乙酯、哌啶、甲醇的用量比为2g～3g：1mL～2mL：0.5mL～1mL：20mL～30mL；所述室温搅拌反应的时间为6～10h；所述重结晶用的温度为90℃。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述7-(二乙氨基)香豆素、橙色固体A、二氯甲烷、甲醇、四氢吡咯的用量比为0.5g～1g：0.5g～1g：2mL～4mL：2mL～4mL：90μL～100μL；步骤4中，所述室温下搅拌反应的时间为20～24h；所述除去溶剂的方法为旋转蒸发。