[发明专利]检测人B-raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测人B‑raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒。本发明提供的试剂盒包括B‑raf基因V600E突变的检测引物对及检测探针、内部质控引物对及质控探针，所述检测引物的正向引物中包含沿5'端到3'端按以下顺序排列的三个部分：1)第一序列，用于识别突变热点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，该序列与野生型模板序列完全匹配，与突变型模板序列有一个碱基错配；2)Spacer，连接第一序列的3'末端和第二序列的5'末端；3)第二序列，与突变位点上游的序列结合，其3'端序列的3‑6bp与第一序列的5'端重叠；其中，第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高6.3℃～11.3℃；本发明的试剂盒简单快捷，灵敏度高达1‰，特异性强，大大降低假阳性率。

技术领域

本发明属于分子生物学基因检测领域，具体涉及一种用于检测人B-raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒。

背景技术

BRAF基因，位于染色体7q34，是RAF家族成员之一，编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该蛋白在调节MAPK/ERK信号通路中起作用，影响细胞分裂，分化和分泌。BRAF基因突变常见于一些恶性肿瘤，例如肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴等。其中尤以BRAF基因V600E的突变频率最高，因为该突变常常与临床不良预后相关，因此BRAF基因V600E突变是临床检测的重要靶点。

目前，关于B-raf基因突变检测的方法很多，已报道的方法包括DNA直接测序法、ARMS-PCR法、高分辨率溶解曲线技术(HRM)、数字PCR法等。其中，直接测序法准确，为突变检测的金标准，但其灵敏度低；HRM法的灵敏度不高，而且不易区分该位点的其它突变；数字PCR方法灵敏度高，但需要昂贵的设备；ARMS-PCR法操作简单，但由于在ARMS引物倒数第2-5个碱基引入一个额外的突变，降低了PCR扩增的效率，检测灵敏度受限，且对于野生型背景的耐受能力差，经常出现假阳性。因此，更好的区分突变型和野生型基因从而提高检测灵敏度和特异性，是ARMS-PCR法技术改进的方向。

发明内容

本发明的目的在于解决临床常用B-raf基因V600E突变检测方法灵敏度低、扩增效率低、检测成本高、野生型背景的耐受能力差等问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种用于检测人B-raf基因V600E突变的引物，包括正向引物与反向引物，正向引物包含沿5'端到3'端按以下顺序排列的三个部分：

1)第一序列，用于识别突变热点并与野生型模板杂交的肽核酸PNA序列，该序列与野生型模板序列完全匹配，与突变型模板序列有一个碱基错配；

2)Spacer，连接第一序列的3'末端和第二序列的5'末端；

3)第二序列，与突变位点上游的序列结合，其3'端序列的3-6bp与第一序列的5'端重叠；

所述第一序列的Tm值比第二序列的Tm值高6.3℃～11.3℃；

所述第一序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示；

SEQ ID NO.1：5'-TCGAGATTTCACTGTAGCTA-3'

SEQ ID NO.2：5'-ATCGAGATTTCACT-3'

SEQ ID NO.3：5'-CATCGAGATTTCACT-3'

所述第二序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示；

SEQ ID NO.4：5'-CTGATGGGACCCACTCCATCG-3'