[发明专利]基于DNA信号放大和血糖仪的超灵敏蛋白检测方法

说明书

本发明公开了基于DNA信号放大和血糖仪的超灵敏蛋白检测方法，目标物分子经DNA信号放大后的产物可以与蔗糖氧化酶修饰的DNA序列发生碱基互补配对，进而催化蔗糖水解为葡萄糖，最后通过商品化的血糖仪检测；然后结合微流控系统，将捕获抗体修饰的超薄玻璃上，具有良好的重现性，灵敏度和特异性，对目标蛋白的快速低成本检测具有重要意义。

技术领域

本发明涉及检测方法，特别涉及基于DNA信号放大和血糖仪的超灵敏蛋白检测方法。

背景技术

常用蛋白的高灵敏度检测具有重要的现实意义。酶联免疫法特异性好，是目前最常用的定量检测蛋白标志物的方法。然而，由于该检测方法通常需要复杂的仪器和熟练操作的专业人员，在不发达国家和地区难以普及。基于此，开发易于实现，操作简便和成本低的技术改进传统酶联免疫法，尤其在资源匮乏的地区，具有广泛的应用前景。

近年来，纳米技术和DNA信号放大技术高速发展，一方面，纳米材料成功的与抗体、聚合物和核酸适配体等多种生物分子相连，形成复合的功能化纳米粒子，成功应用于生物传感，细胞成像和基因调控方面。基于此，在酶联免疫法中的抗体可以用DNA功能化的纳米结构标记，该DNA标记的功能化材料可以通过聚合酶链式反应、杂交链式反应或者滚环扩增技术实现信号放大，通过该项技术，免疫反应的灵敏度与传统的酶联免疫法相比，可以提高多个数量级。在基于DNA信号放大的酶联免疫法中，催化发夹DNA探针自组装反应和杂交链式反应的放大程度有限；聚合酶链式反应虽信号放大程度高，但是其反应过程需要严格的升温和降温过程，限制了其扩大应用。比较而言，滚环扩增放大技术具有独特的优势，它采用等温扩增，可以实现信号分子10⁵到10⁹甚至是指数数量级的放大。在滚环扩增放大技术中，仅仅一段短链DNA作为目标物，通过与环状DNA模板结合，该目标物可以延长为具有无数个重复单元的长链DNA，该DNA的尺寸大概在1微米左右，很容易通过荧光染料或酶标记，在生物传感，成像等方面具有广泛的应用潜力。而商品化血糖仪具有尺寸小，成本低和易于操作的优点，是目前应用最成功的床旁检测仪器。

因此，将被测物蛋白标志物通过放大、间接转化为可通过商品化血糖仪检测对开发快速低成本测定方法具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于DNA信号放大和血糖仪的超灵敏蛋白检测方法，通过将目标物分子经DNA信号放大后的产物可以与蔗糖氧化酶修饰的DNA序列发生碱基互补配对，进而催化蔗糖水解为葡萄糖，最后通过商品化的血糖仪检测。

该方法可以使用微流控系统，通过在检测通道修饰抗体，其他试剂均可通过注射泵注入反应区域，具有良好的重现性。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于DNA信号放大和血糖仪的超灵敏蛋白检测方法，包括如下步骤：

(1)免疫夹心反应：将含有目标蛋白的待测液加入包被抗体Ⅰ的反应区使目标蛋白与抗体Ⅰ充分反应，然后加入修饰有环化的锁式DNA和抗体Ⅱ的金纳米粒子使抗体Ⅱ与目标蛋白充分反应，形成免疫夹心复合物；抗体Ⅰ和抗体Ⅱ能够特异识别目标蛋白；

(2)滚环扩增反应：将步骤(1)所得免疫夹心复合物的进行滚环扩增，形成含有无数个重复单元的长链结构；

(3)葡萄糖转化：将步骤(2)滚环扩增产物与蔗糖氧化酶修饰的DNA链(简称T3-蔗糖氧化酶)反应，所述DNA链通过与滚环扩增产物发生碱基互补配对固定蔗糖氧化酶，然后蔗糖氧化酶催化蔗糖水解为葡萄糖，最后通过血糖仪检测反应产物中血糖含量。