[发明专利]一种鉴定金环胡蜂的DNA条形码标准检测片段及其应用

说明书

本发明公开了一种鉴定金环胡蜂的DNA条形码标准检测片段及其应用，属于生物物种鉴定领域，本发明公开了一种DNA条形码标准检测基因序列SEQ ID NO.1，以及利用该CO II基因序列及PCR扩增技术对昆虫药材金环胡蜂进行分子鉴定的关键技术；PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳进行验证后进行测序，将测序结果通过手工校对、序列拼接，并与本发明公开的CO II基因序列进行比对，同源性在98％或以上，则可以判断待鉴定昆虫药材为金环胡蜂来源；本发明的DNA分子鉴定技术实现了对药材鲜品或干品、全虫或部分虫体、蛹或幼虫或成虫的快速、准确可靠的鉴定，确保了金环胡蜂作为药材入药的安全性。

技术领域

本发明涉及生物物种鉴定领域，特别是涉及一种鉴定金环胡蜂的DNA条形码标准检测片段及其应用。

背景技术

金环胡蜂(Vespa mandarinia Smith)为膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespidae)胡蜂属(Vespa)中体型最大、性情凶猛的捕食性肉食昆虫，俗称“虎头蜂”，也称中华大虎头蜂、斑胡蜂、桃胡蜂、人头蜂等。其幼虫、全体及蜂巢均可入药，药材名大黄蜂(全体)、大黄蜂子(幼虫)、露蜂房(蜂巢)，主治风湿痹痛。胡蜂味甘辛、性温，主治风湿痹痛，其成虫和幼虫有祛风除湿之功效，可治急慢性风湿痛、风湿性关节炎；胡蜂房有定痛、祛风、驱虫、消肿解毒等功效，主治惊痛、风痹、疗毒、牙毒、乳痛等；而蜂毒主要应用于蜂蛰过敏症、心血管系统疾病、风湿关节炎及疮疡等疾病。根据《中国民族药志要》记载，金环胡蜂是一种彝药，具有治疗风湿、全身疼痛和麻木的作用。另外，以金环胡蜂为原料，配制成酒供人饮用在我国民间有着悠久的历史，金环胡蜂蜂子酒具有活血通络、祛风除湿、改善血液循环的作用。可以预料金环胡蜂将会为人类医疗保健事业发挥巨大作用。因而准确的物种鉴定是物种分布调查及种群发生动态研究的前提，也是金环胡蜂进行深入研究和药物开发的基础。由于包括金环胡蜂在内的胡蜂科昆虫具有着较高的药用价值，近年来，在昆虫生物医药的开发利用进程中，胡蜂成了研究的热点，对其药理作用的研究越来越多，其药物制剂在临床上的应用也越来越广泛，而对胡蜂的物种鉴定是药物开发利用的前提和基础。

然而，由于药材收集者、销售者及胡蜂养殖户缺乏物种鉴定所需专业技术，导致金环胡蜂的混伪品涌入药材市场。入药胡蜂的种类不同，其所含的有效成分和药用功效、毒副作用都可能不同；混伪品入药除可能无法达到应有的药物疗效，甚者可能致使服用者产生不良反应。因此，为了保证药物的疗效及安全性，金环胡蜂及其混伪品不能彼此混淆和替代，而需要给予准确的鉴定和细致的划分。目前针对金环胡蜂的鉴别方法有性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等方法，但这种传统的物种鉴定主要依赖于专业的昆虫分类学家花费大量时间和精力积累并整理所描述的形态特征，不仅费时费力，而且常受主观因素干扰，容易混淆出错；其次，由于(1)金环胡蜂与其近缘种之间的区别特征少且不明显，传统方法容易造成错误鉴别；(2)用传统的方法几乎无法做到鉴定同种金环胡蜂的不同生物型；(3)传统的鉴定方法难以提供针对金环胡蜂幼虫、蛹或残缺个体的鉴定；因此传统鉴定方法存在较大的局限。近年来，随着分子生物学技术的发展，从体现物种遗传本质的DNA分子入手而形成的DNA条形码技术已成为物种鉴定的有效分析手段。

DNA条形码技术(DNA Barcoding)是近年来发展起来的物种鉴定新方法。2003年，加拿大分类学家Paul Hebert提出了DNA条形码的概念，它是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异性的、易扩增且相对较短的DNA片段。通过对基因组中一段公认的、相对较短的DNA片段进行序列分析，可以有效弥补传统物种鉴定方法的不足，因而成为生物分类和鉴定的研究热点和方向。Ball等(2005年)用DNA条形码鉴定了70多种水生蜉蝣；游中华等(2007年)用线粒体CO I基因鉴定了入侵害虫西花蓟马及其他常见8种蓟马；岳巧云等(2010年)直接将DNA条形码技术应用于未知昆虫幼虫种类的鉴定，达到了预期的效果。而现有文献尚未有用于鉴定金环胡蜂的DNA条形码技术的相关报道。

发明内容