[发明专利]一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法

说明书

本发明公开了一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，其步骤为：（A）将GelMA粉末和光引发剂溶于PBS中，在40‑50℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为5‑15%的GelMA溶液；（B）将新鲜脂肪组织预处理后，捣碎处理，分别经0.25%胰蛋白酶‑0.1%EDTA处理和3%Triton‑X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理；（C）将步骤（B）脱细胞外基质溶于0.01M HCL和1mg/mL的胃蛋白酶溶液中，4‑10℃搅拌，低速离心10min，配制最终浓度为5‑15 mg/mL脱脂肪细胞外基质溶液；（D）将步骤（A）制备的GelMA在适宜的温度下预热，涡旋震荡速度1500‑2500rpm的条件下，将步骤（C）溶液缓慢加入，其中GelMA与脱细胞外基质体积比为1‑4:1，经调节pH及灭菌后即可得。该方法制备的复合生物墨水具有优异的打印性、生物相容性和生物活性。

技术领域

本发明涉及一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法。

背景技术

传统二维细胞培养由于不能仿照肿瘤的三维环境下细胞间的相互作用以及缺少相应的细胞外基质（ECM）而与真实肿瘤微环境差异较大；而动物模型与人体存在较大的种族差异难以反应人体真实的肿瘤环境，且存在伦理问题。因此导致临床上对肿瘤的发病，治疗和转移理解存在偏差，仿生的含有细胞外基质和多种活性细胞三维肿瘤模型可为体外直观研究肿瘤发展、转移、抗肿瘤药物研发和筛选提供可靠的平台。

3D生物打印是基于医学图像转换或者计算机辅助（CAD）设计的模型，然后在计算机精确控制下，将含有活细胞的生物打印墨水层层打印成型，体外构建仿生的三维肿瘤结构。近五年来，3D生物打印技术有具有较好的空间控制，较快的打印速度，较高精度的复制能力而被广泛应用在肿瘤模型的构建中。理想的生物墨水需要同时满足良好的打印性（快速固化能力），合适的力学支撑性，优良的生物相容性和优异的生物活性。虽然已经有部分研究尝试利用天然和合成的水凝胶材料（如海藻酸钠，明胶，透明质酸，纳米纤维素，聚乙二醇，聚乙烯醇）在体外构建三维肿瘤模型。在打印性方面，现有生物墨水仍然存在注射能力差，固化速度慢，力学强度低和降解性能不可控等缺点；在生物活性方面，现有生物墨水生物活性较低，缺乏促进细胞增殖，分化和特异性功能表达的ECM相关生物化学信号，难以概括真实细胞的培养条件。由于缺乏同时具有良好打印和仿细胞基质成分的生物墨水，导致3D生物打印构建体外仿生的三维肿瘤模型仍存在挑战。脱细胞外基质材料保持细胞生长的微环境，包括胶原、蛋白、多糖以及理化因子，但是其成型性较差难以被打印成型，因此需要与固化性能较好的材料进行复合，如具有优异生物相容性和快速光固化能力的明胶甲基丙烯酸酐（GelMA）。为解决上述难题，本发明制备了一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，该制备方法工艺简单、制备成本低；所制备的复合生物墨水能够仿肿瘤细胞外基质成分，具有优良的生物相容性和生物活性，三维细胞培养活性高具有正常的生物学功能；应用在3D生物打印领域，其打印性良好，保证打印后的仿生三维结构精度高，力学强度可控性强，能够精确的模拟肿瘤三维微环境。

本发明实现其发明目的所采用的技术方案是：

一种仿细胞外基质可打印复合生物墨水的制备方法，包括以下步骤：

（A）GelMA溶液的配制：将GelMA粉末和光引发剂溶于PBS中，在40-50℃搅拌至均匀，配成浓度最终浓度为5-15% (w/v)的GelMA溶液；

（B）脱脂肪细胞外基质制备：将新鲜脂肪组织预处理后，20000-30000rpm捣碎处理5-10min，分别经0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA处理和3% Triton-X100处理1h后，经4%的脱氧胆酸钠和100%异丙醇分别处理1h和6h，即得；