[发明专利]一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法

权利要求书

1.一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)引物设计：为目的基因和待添加或替换的新蛋白标签分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2之间要有15bp同源臂，F1和R2分别与被限制性内切酶双酶切之后的线性表达载体的两端要有15bp同源臂；

(2)目的基因和待添加或替换的新蛋白标签片段扩增：以含有目的基因的载体为模板，以F1、R1为引物对其进行PCR扩增；同样以含有待添加或替换的新蛋白标签的载体为模板，以F2、R2为引物对其进行PCR扩增，分别扩增出目的基因片段和待添加或替换的新蛋白标签片段；

(3)表达载体双酶切及重组酶处理：将表达载体用限制性内切酶双酶切得到线性表达载体，将步骤(2)获得的目的基因片段、待添加或替换的新蛋白标签片段和线性表达载体在重组酶反应体系下进行重组酶处理快速添加或替换目的基因的蛋白标签获得重组表达载体；

快速添加目的基因的蛋白标签时，线性表达载体保留表达载体的原有蛋白标签且添加新的蛋白标签；

快速替换目的基因的蛋白标签时，线性表达载体酶切去除表达载体的原有蛋白标签替换为新的蛋白标签；

(4)转化：将步骤(3)获得的重组表达载体转化大肠杆菌T1感受态并进行平板筛选获得阳性转化子；

(5)阳性转化子检测：挑取阳性转化子单克隆菌落进行扩大培养后，以引物F1、R2为引物对进行菌落PCR，将PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后获得的目的条带进行测序；

(6)测序比对：完成目的条带测序后进行测序结果比对，若序列正确即可得到重组菌株，或者从重组菌株中提取质粒进行下一步其它试验。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的目的基因为如SEQ ID NO:1所示的切除信号肽的S₇-RNase蛋白基因，含有目的基因的载体为载体pCold-TF-S₇-RNase；含有待添加的新蛋白标签的载体为载体p1300-35S-GFP；步骤(3)中表达载体为载体pCold-TF，用NdeI和XhoI双酶切得到线性载体pCold-TF；步骤(1)中所设计的引物序列为：

S₇+GFP-F1：GGTATCGAAGGTAGGCATATGATGTACGATTATTTTCAATTTACGCAGC

S₇+GFP-R1：GCCCTTGCTCACCATggatccATACTTAACATCGGCCGGGC

S₇+GFP-F2：GCCGATGTTAAGTATggatccATGGTGAGCAAGGGCGAG

S₇+GFP-R2：CTTGAATTCGGATCCCTCGAGGTACAGCTCGTCCATGCCG。