[发明专利]小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin突变的免疫荧光试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、甲醇200μl、2% PFA 200μl 、10%山羊血清100μl 、一抗工作液100μl、二抗工作液100μl、DAPI封片剂。

2.根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述一抗工作液是由小鼠抗CK、大鼠抗CD45和 兔抗E-Cadherin组成，分别采用BD wash buffer按1:1001:5001:400稀释混匀；所述二抗工作液是由荧光标记的小鼠抗羊、荧光标记的大鼠抗羊和荧光标记的兔抗羊组成，分别采用BD wash buffer按1:500稀释混匀2。

3. 根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+0.1% BSA+0.1%海藻糖+0.2%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物组成，所述基础液为Tris-HCl缓冲剂。

4.根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。

5.根据权利要求1所述的免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。

6.一种利用权利要求1-5任一项所述的免疫荧光试剂盒非诊断目的检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发小细胞肺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发小细胞肺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；

（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；

（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；

（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，向滤器中加入200μl 2% PFA，室温固定5min，完成后0.5ml PBS漂洗3次，每次2min；再向滤器中加入200μl预冷的甲醇，4℃固定15min；取下滤膜，将滤膜下表面平整的贴附到载玻片一侧，将载玻片置于室温干燥4-5min后，使用镊子快速将滤膜从载玻片表面一次性揭起，转移至载玻片中央，滴加2ul贴片剂，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；

（5）运用免疫荧光法检测CTC的E-Cadherin表达情况。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测CTC的E-Cadherin表达的具体方法如下：

（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，PBS洗2min×3次；

（2）封闭：向滤膜上滴加100μl 10%山羊血清，室温放置30min，完成后吸去多余的血清；

（3）一抗孵育：弃掉载玻片上的封闭液，并立即滴加100μl一抗稀释液置于湿盒37℃孵育60min（或4℃过夜孵育，次日置于37℃复温30min）；

（4）完成后PBS漂洗3次，每次3min；

（5）二抗孵育：滴加100μl二抗稀释液，室温孵育30min；

（6）完成后PBS漂洗3次，每次2min；

（7）使用含DAPI的封片剂封片，阅片，采图；

（8）采照完成后，脱片后进行瑞氏吉姆萨染色，与IF结果进行对比。