[发明专利]基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法及PCR仪

说明书

本发明涉及PCR检测装置技术领域，提供了一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法及PCR仪，PCR仪包括试管架、试剂管、光源模块和采集模块；校准方法包括将放置有试剂管的孔位标记为至少一个基准孔和若干测试孔；驱动光源模块发射激发光；通过采集模块采集图像，提取图像的灰度值；根据基准孔和测试孔将提取到图像的灰度值分为基准孔灰度值和测试孔灰度值；根据基准孔的基准孔灰度值和各测试孔的测试孔灰度值，计算得到各测试孔的校准系数；根据各测试孔的测试孔灰度值和各测试孔的校准系数，计算得到各测试孔校准后的测试孔灰度值。本发明克服了由于试剂管与镜头光轴的夹角不同，造成各孔位荧光存在偏差的问题，确保基因检测准确性。

技术领域

本发明涉及PCR检测装置技术领域，特别是涉及一种基于POCT的荧光定量PCR仪校准方法及PCR仪。

背景技术

传统的荧光定量PCR仪，以科研应用场景需求进行设计，反应管采用通用的八联管，荧光检测系统设置在反应管上方，激发光源从试剂管顶部射入，激发出的荧光也需要在反应管顶部检测，因此荧光检测系统需设置有热盖，热盖和反应管盖采用高透明的光学材料，同时为了避免激发光路与荧光光路相互干涉，PCR仪器需使用分光镜、合光镜等光学元件，整个光路比较复杂，体积较大，成本昂贵，生产装调工艺复杂。

为提升检测精度，PCR需要进行荧光校准，由于光源、发射滤镜、分光镜、接收器对不同光谱的响应不同及不同孔位光路光程有差异，因此需分别对每个通道、每个孔位进行荧光校准。传统的校准方法需要配制不同通道相应的染料标准品和纯水标准品，每种标准品需与设备孔位数一致，若设备孔位为96，则每种标准品都需要96支。理论上每支标准品是完全一致的，即每一支标准品在相同的激发光源的作用下检测到的荧光完全一致，然而不同支标准品的浓度、装量及耗材光学性能难免存在差异，标准品的误差会影响校准的精度。一般的，为减小标准品误差对校准精度的影响，需要加大标准品的用量和测试频次，通过计算平均等数据处理方式降低随机误差。此外，荧光染料存在光热稳定性差的问题，重复使用越多标准品间的偏差越大，因此，荧光校准须控制染料的重复使用次数，进一步推高了荧光校准的成本。复杂的光路，繁多光学元件，势必造成成本高、生产工艺复杂、调测难度大等问题，再加上荧光校准操作繁琐、标准品消耗量大，导致传统的荧光PCR制造成本高，售价高昂，限制了其推广应用。

在临床SNP基因检测上，使用传统的荧光定量PCR操作复杂，其检测的基本流程为：

(1)检测试剂准备，具体为检测试剂各组分融解、离心、混合、分装到PCR反应管；

(2)检测样本制备，具体为DNA提纯、浓度及纯度检测；

(3)样本加样，具体为用移液器将样本DNA加到已分装检测试剂的PCR反应管内。

(4)上机扩增，具体为将加样后的试剂上机，设定PCR反应程序，启动运行，结束后分析数据，出具检验报告。

由于检测操作复杂，且极易出现交叉污染，造成检测结果错误；要求检测环境及管理必须满足PCR实验室特殊要求，操作人员也必须具备PCR检测相关技能及要求。为规范临床基因检测实验室管理，确保基因检测质量和实验室生物安全，国家出台了《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》及《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》，对临床基因检测涉及的实验室审核及设置、质量管理、监督管理进行了详细的规定，同时对实验室的设计、软硬件设施(实验室区域划分、气流流向、软硬件设备配置等)要求，工作基本准则及人员要求等，均做出了明确规定，并必须按规定要求执行。