[发明专利]一种表达荧光素酶的重组犬麻疹病毒

说明书

本发明的目的是提供一种表达荧光素酶NLuc的重组犬麻疹病毒，其中用于拯救表达NLuc的重组CMV核酸片段的结构为5′‑N‑P‑NLuc‑M‑F‑H‑L‑3′；其中，N、P、M、F、H、L为病毒的结构基因；NLuc为荧光素酶的ORF，该ORF上游包含M基因起始序列和Not I酶切位点，下游包含Pme I酶切位点及P基因终止序列。本发明通过反向遗传技术拯救的rCMV‑NLuc，在细胞内对于NLuc的表达水平较高，在发光底物furimazine作用下，可发出肉眼可见的淡蓝色荧光。外源基因的插入并未显著影响病毒的生长动力学，且外源基因在病毒传代过程中相对较为稳定。

技术领域

本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种表达荧光素酶的重组犬麻疹病毒。

背景技术

犬麻疹病毒(canine morbillivirus,CMV)，旧称“犬瘟热病毒(canine distempervirus)”，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)成员。CMV的宿主广泛，犬科动物、鼬科动物、猫科动物等均易感染。病毒侵入机体24h内，主要在局部组织的巨噬细胞内增殖，而后扩散到扁桃体和支气管淋巴结单核细胞中，引起扁桃体和支气管淋巴结肿大；在感染后2～4d内持续复制，随后扩散到其他淋巴器官。患病动物的临床症状通常是呼吸系统、胃肠消化系统、表皮黏膜和中枢神经系统症状，伴随着双相热、全身不适和病毒血症。

CMV基因组为单股、负链、线性的RNA，全长15 690nt，编码六个结构蛋白(N、P、M、F、H、L蛋白)和两个非结构蛋白(C、V蛋白)。病毒经纯化后电镜下观察形状不定，但多呈球形或椭球形，外披脂质囊膜，囊膜外表面嵌有铆钉状纤突。囊膜内表面紧邻基质蛋白，其单体之间相互作用构成了整个病毒的外骨架，内部则含有鲱鱼骨状螺旋型核衣壳。CMV具有溶瘤活性，是一种理想的溶瘤病毒。溶瘤病毒的溶瘤活性研究可借助于小动物体内发光影像，使其溶瘤效果的观察更为直观。因此构建一种表达荧光素酶(而非荧光蛋白)的重组溶瘤病毒，将为其下游溶瘤活性的研究奠定良好的基础。

萤光素酶(luciferase,NLuc)是一个经基因工程改造的小分子酶，分子量为19.1kD，是新型生物发光报告蛋白。NLuc可催化一种新型底物furimazine，从而产生高强度、辉光型发光现象。NLuc催化的生物发光反应不依赖ATP，自发光背景低，光信号较传统荧光素显著增强，同时抑制背景发光，可获得极高检测灵敏度。NLuc作为一种荧光示踪蛋白(Genbank登录号：MH037010)，因开放阅读框(open readingframe,ORF)较短(516bp)，因此极大方便了基因操作。但目前仍未有借助CMV高效表达NLuc的有效方法。

发明内容

本发明目的是提供一种表达荧光素酶(NLuc)的重组犬麻疹病毒(rCMV-NLuc)，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种用于拯救表达NLuc的重组CMV核酸片段(rCMV-NLuc cDNAclone)，所述核酸片段的结构为：5′-N-P-NLuc-M-F-H-L-3′。其中，N、P、M、F、H、L为病毒的结构基因；NLuc为荧光素酶的ORF，该ORF上游包含M基因起始序列(M GS)和Not I酶切位点，下游包含Pme I酶切位点及P基因终止序列(P GE)。

作为实施例的一种具体记载，所述核酸片段的序列为SEQ ID NO:1；

本发明所提供的核酸片段用于在细胞内拯救能够表达NLuc的重组犬麻疹病毒；

所述的细胞为BSR-T7/5细胞和Vero-Dog-SLAM(VDS)细胞，两者分别用于重组病毒的拯救和传代；

本发明再一个方面提供一种能表达NLuc的重组犬麻疹病毒，所述的病毒是使用表达NLuc的重组CMV核酸片段的重组质粒在细胞内拯救获得的。