[发明专利]一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs及其应用

说明书

本发明公开了一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs及其应用，本发明通过饲喂苏云金芽孢杆菌侵染小菜蛾三龄幼虫，从小菜蛾中肠体内筛选到一类可抑制酚氧化酶原激活蛋白酶PAP1的转录和表达的miRNAs，所述miRNAs可以降低或中断害虫的酚氧化酶途径的激活，导致小菜蛾天然免疫降低或者消失，导致害虫更易感染病原物而快速死亡。本发明提供了一种新的控制害虫免疫系统的分子靶标，可开发成调节害虫免疫系统的生物农药。本发明提供的方法，尤其是杀鳞翅目害虫小菜蛾的杀虫剂组合物，发明具有特异性强、不杀伤有益生物、无残留、无毒副作用等优点，是一种新型的生物防治策略。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，更具体地，涉及一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs及其应用。

背景技术

酚氧化酶(Phenoloxidase，PO)是昆虫体内的一种重要的免疫蛋白，PO介导的黑化反应不仅在昆虫先天免疫中起着重要作用，而且在昆虫伤口愈合、表皮糅化等生理过程也有重要作用(Tanji et al.,2005；Lemaitre and Hoffmann,2007；Cerenius et al.,2010)。PO在昆虫血淋巴中往往以无活性的多酚氧化酶原(prophenoloxidase，PPO)形式存在。对烟草天蛾等昆虫研究表明，在昆虫遭受病原微生物侵染或创伤等刺激时，昆虫体内的模式识别蛋白(pattern recognition proteins，PRPs)识别并结合病原物表面特有的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，依赖丝氨酸蛋白酶(Serine proteases，SPs)或在丝氨酸蛋白酶同系物(Serine protease homologs，SPHs)的辅助下，通过一系列级联反应，激活酚氧化酶原活化蛋白酶(PPO-activatingproteinases，PAPs)在特异位点切割PPO释放出有活性的PO，介导了黑化反应。

酚氧化酶原激活蛋白酶(Prophenoloxidase activating proteinase，PAP)是酚氧化酶原激活系统中的重要一员，属于丝氨酸蛋白酶家族。在激活系统中，PAP自身或者在辅助因子(丝氨酸蛋白酶同系物，SPH)的作用下，无活性的酚氧化酶原被微生物细胞壁成分激活的丝氨酸蛋白酶逐步激活生成有活性的酚氧化酶发挥作用，被激活的酚氧化酶将酪氨酸羟基化为多巴，多巴发生氧化生成多巴色素，黑素前体(吲哚醌)被二羟吲哚氧化产生，黑色素在多巴脱羧以及多巴色素转化酶的共同作用下形成，其对昆虫的生长具有保护的作用，使昆虫避免受外来物的入侵。

microRNA是真核生物体内一类非编码的核苷酸，在调节基因表达方面具有重要作用，其长度一般为18～25个核苷酸，对于基因转录后的mRNA的抑制或降解其翻译或者调控组蛋白修饰具等从而对转录后调控表达具有重要的调控意义；一般来说，miRNA可以通过miRNA介导的mRNA降解和P小体的螯合、翻译起始后抑制蛋白形成、翻译延伸前抑制等来下调靶基因的表达(陈楠菁，2016)。通过调控靶基因的表达而进一步表现出对昆虫的生长发育、细胞凋亡与分化、激素的分泌、抗病毒、免疫防卫等重要生物过程具有重要的调控作用。许多研究都显示着miRNA具有巨大的作用和潜力，可以通过miRNA来研究基因功能和摸索基因、生物进化以及人类疾病防治与治理的探索等都具有极大的研究价值与意义和无穷的潜力(俞焙秦等，2007)。对于miRNA与基因互作或者调控基因水平表达研究的成果日益增多，2013年鲁莎等，通过研究被半闭弯尾姬蜂寄生后的小菜蛾，发现其miR-8与丝氨酸蛋白酶抑制剂转录水平具有正向调控关系。这研究表明在被半闭弯尾姬蜂寄生后的小菜蛾其miR-8表达水平降低而与之对应的Serpin27转录水平显著下降。可见miRNA能够在一定程度上调控昆虫的免疫应答反应(鲁莎等，2019)。在农作物上通过基因工程把害虫的特定miRNA转入到农作物内，结果发现害虫表现出脱皮过程不正常而致死，可见转特定miRNA在未来有可能成转基因作物的一种新选择(鲁莎等，2019)。但是，目前还未见有可抑制小菜蛾PAP1基因表达，抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs的相关报道。

发明内容