[发明专利]一种基于AuNPs@rGO@PS NSs的电化学传感器的制备方法及应用

权利要求书

1. 一种基于AuNPs@rGO@PS NSs的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将直径为3 ~ 5mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；

（2）将6 μL、1.0 ~ 3.0 mg/mL Au-Ag/rGO@PDA分散液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，室温晾干；

（3）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的载脂蛋白E4捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中干燥；

（4）继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，以封闭电极表面上的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4°C冰箱中晾干；

（5）继续滴加6 µL、0.03 ~ 2000 ng/mL的一系列不同浓度的载脂蛋白E4抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；

（6）继续滴加6 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL的检测抗体孵化物AuNPs@rGO@PS NSs-Ab₂溶液于电极表面，置4 ℃冰箱中孵化40 min、超纯水冲洗、晾干，制得一种基于AuNPs@rGO@PS NSs的电化学传感器；

所述Au-Ag/rGO@PDA分散液的制备，步骤如下：

（1）Ag/rGO@PDA的制备

称取30 ~ 50 mg氧化石墨烯、将其分散在40 mL超纯水中并超声30 min，加入150 μL、28 wt%的氨水溶液；搅拌30 min后缓慢加入7.5 ~ 12.5 mL、10 mM的硝酸银溶液，反应10min；加入浓度10 mM、 pH = 8.5的含有0.5 mg/mL多巴胺的三羟甲基氨基甲烷缓冲液30 ~50 mL，60 ℃水浴中搅拌10 h；所得产物超纯水离心洗涤三次，制得Ag/rGO@PDA，重新分散于10 mL超纯水中备用；

所述pH = 8.5的含有0.5 mg/mL多巴胺的三羟甲基氨基甲烷缓冲液的配制方法如下：取50 mL、0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与14.7 mL、0.1 mol/L HCl混合，加入50 mg多巴胺，超纯水加至100 mL混合均匀，室温保存；

（2）Au-Ag/rGO@PDA分散液的制备

取4 ~ 6 mL上述制备的Ag/rGO@PDA溶液于离心管中，加入1 mL、1%氯金酸，超声分散，缓慢加入2 mL、1%的抗坏血酸溶液，室温下搅拌2 h；所得产物用超纯水离心洗涤三次，40 °C真空干燥箱中干燥后制得Au-Ag/rGO@PDA；

取5 ~ 15 mg Au-Ag/rGO@PDA粉末，超声分散于5 mL的超纯水中，制得Au-Ag/rGO@PDA分散液，放置在4 °C的冰箱中，备用；

所述检测抗体孵化物AuNPs@rGO@PS NSs-Ab₂溶液的制备，步骤如下：

（1）AuNPs@rGO@PS NSs的制备

称取1.0 ~ 3.0 g石墨粉和0.5 ~ 1.5 g硝酸钠，分散在2.0 ~ 6.0 g、10 wt %聚苯乙烯水溶液中；超声处理30 min，加入120 mL超纯水并在室温下搅拌6 h；缓慢加入200 μL、80wt %的水合肼，加热至在95 ℃保持4 ~ 6 h；冷却至室温将所得黑色混合物超纯水离心洗涤三次，65 °C真空干燥箱中干燥；

称取17.3 mg的黑色混合物超声分散在17.3 mL乙二醇中；后加入600 ~ 700 μL、10mg/mL氯金酸，用1 M氢氧化钠调节酸碱度至11.0；将上述混合物至于置于微波炉中加热；将所得产物分别用超纯水和无水乙醇洗涤三次，40 °C真空干燥箱中干燥后制得AuNPs@rGO@PS NSs；

（2）检测抗体孵化物AuNPs@rGO@PS NSs-Ab₂溶液的制备

将1 ~ 3 mL、2 mg/mL的AuNPs@rGO@PS NSs溶液加入到0.5 ~ 1.5 mL浓度为10 μg/mL的载脂蛋白E4检测抗体溶液Ab₂中，4 ℃恒温振荡箱中震荡孵化12 h，超纯水离心洗涤，加入1 ~ 3 mL、pH = 7.38的磷酸缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物AuNPs@rGO@PS NSs-Ab₂溶液，4 ℃下保存备用。

2.如权利要求1所述一种基于AuNPs@rGO@PS NSs的电化学传感器的制备方法制备的传感器，用于载脂蛋白E4的检测，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、含10 mmol/L铁氰化钾溶液中进行测试；

（2）用计时电流法对载脂蛋白进行检测，选择-0.4 V作为电流测量的检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH = 7.38磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。