[发明专利]一种筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法

说明书

本发明涉及一种用于筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法。该方法是以厌氧盒和96孔培养板为培养装置，以厌氧培养液的排油圈直径作为筛选指标。主要步骤：样品预处理，涂布LB琼脂平板、根据菌落形态挑选菌落，接种至96孔培养板、置于厌氧盒中培养，培养液排油圈直径测定，厌氧扩大培养和表面张力测定验证。本发明方法是一种简便、高效、高通量的筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法，为环境样品中生物表面活性剂厌氧产生菌的菌种资源开发与研究奠定了方法基础。

技术领域

本发明涉及环境生物技术和微生物资源开发领域，具体为一种用于筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法，是一种简便、高效、高通量的筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法，为环境样品中生物表面活性剂厌氧产生菌的菌种资源开发与研究奠定方法基础。

背景技术

生物表面活性剂主要是由微生物合成的具有表面活性的代谢产物，包括糖脂类、脂肽类等，具有降低表/界面张力、乳化、增溶等功能。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂具有活性高、低毒或无毒、易生物降解、生态友好等优点，在石油开采、环境污染修复、农业、医药、食品等领域具有广阔的应用前景。当前菌种资源开发得到的生物表面活性剂产生菌基本上只能够在有氧条件下合成生物表面活性剂，限制了生物表面活性剂产生菌在某些缺氧环境中的高效应用，如油藏原位产表面活性剂驱油以及河流底泥的污染修复等领域。目前已报道的能够在厌氧条件下合成生物表面活性剂的菌种资源还比较匮乏，可检索到的文献资料不足 10 篇，而筛选到的能够厌氧合成生物表面活性剂的野生型菌则更少。

自然界中存在着丰富的微生物资源，如土壤、油藏、底泥等环境的缺氧特性形成了其独特的微生物类群和丰富物种多样性与代谢功能多样性，为筛选能够厌氧合成生物表面活性剂的微生物菌株提供了可能。然而筛选能够厌氧合成生物表面活性剂菌株，采用目前文献报道的方法和已存在的筛选方法，筛选效率低、操作繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选能够厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法，有利于解决现有生物表面活性剂厌氧产生菌的菌种资源匮乏，生物表面活性剂厌氧产生菌的筛选操作繁琐、筛选效率低等问题，采用该方法可以简单、高效地筛选获得厌氧合成生物表面活性剂的菌种资源。

本发明所提供的筛选能够厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法，以厌氧培养盒和96孔培养板为培养装置，以厌氧培养液的排油圈直径作为筛选指标，具体步骤如下：

1）环境样品预处理后涂布LB琼脂平板，厌氧培养；2）挑取不同形态的单菌落接种至装有液体发酵培养基的96孔培养板中，厌氧培养；3）取厌氧培养液，测定其排油圈直径，4）选取厌氧培养液排油圈直径为10~125mm的菌株，进行厌氧扩大培养和厌氧发酵液的表面张力测定验证。

步骤1）环境样品包括泥样、土样和水样等，其中水样进行普通滤纸过滤除去悬浮物，泥样和土样利用无菌去离子水和玻璃珠制备悬液。在超净工作台中取0.1mL~0.5 mL预处理后的环境样品涂布LB琼脂平板，共涂布3~5个LB琼脂平板，涂布后的LB平板水平放置于厌氧培养盒中，将厌氧培养盒放在恒温培养箱中培养3~6天；培养温度为25℃~45℃。

步骤2）利用无菌牙签从厌氧培养后的LB琼脂平板上挑取若干菌落形态不同的单菌落，分别接种至装有0.08~0.12 mL液体培养基的96孔培养板的小孔中，至少留下两孔不接种作为空白对照，并覆盖上无菌膜；96孔培养板水平放置于厌氧培养盒中，将厌氧培养盒放在恒温培养箱中培养4~8天；培养温度为25℃~45℃。

步骤2）挑取单菌落时，挑取尽可能多的不同形态的单菌落；而相同形态的单菌落中挑取至少一个。

步骤3）取直径90~150mm规格的培养皿放置在毫米网格坐标纸上，培养皿中加入20~50 mL去离子水，中央滴入20~50 μL粘度2~50 mPa·s的石油，待油膜均匀铺开后，利用带有无菌枪头的移液枪或八联排抢分别从96孔培养板的小孔内取10~20μL培养液，滴在油膜上，测量排油圈直径。