[发明专利]乙型肝炎病毒(HBV)特异性B细胞表位检测方法及其应用

说明书

本发明公开了乙型肝炎病毒(HBV)特异性B细胞检测方法及其应用。本方法首次利用HBV病毒蛋白重叠多肽对HBV感染者血清抗体识别的HBV蛋白B细胞线性表位进行检测，克服了现有技术中无法检测HBV特异性B细胞表位的技术缺陷；本发明使用的单肽检测浓度仅需0.68μg/mL，成本低，操作简单，快速，检测结果相较与现有技术更加准确，尤其是对于常规方法无法检测的慢性HBV感染，本发明在能完全检测到的情况下，还能对表位做出准确的分析，具有极高的市场价值。

技术领域

本发明涉及细胞检测领域，具体涉及乙型肝炎病毒(HBV)特异性B细胞表位检测方法及其应用。

背景技术

HBV感染可导致严重肝病，包括急性和慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌。1990年至2015年之间，世界肝癌的发病率增加了75％，其中42％为HBV继发的相关肝细胞癌(HCC)。最新统计表明，病毒性肝炎已成为全球发病率和死亡率的第七大诱因，每年共计造成全球145万人死亡，其死亡率远超艾滋病毒、疟疾和结核病。

在HBV感染过程中，适应性免疫应答决定了HBV感染的预后。既往研究多聚焦于HBV特异性T细胞免疫应答方面，对HBV特异性B细胞的作用机制研究较少。

目前，现有技术中对于B细胞表位研究方法的方法主要有蛋白质化学技术、分子生物学技术、噬菌体表达肽库法、预测法、X射线晶体衍射以及NMR(核磁共振)技术等。

蛋白质化学技术，主要通过化学试剂或酶处理抗原，将抗原分解成多种小片段，通过分析这些抗原小片段与抗体或者抗血清的作用判定抗原-抗体相互作用的位置。或采用水解抗原-抗体复合物法(即蛋白质足迹分析，protein footprinting)。但蛋白质化学技术也存在着很多缺陷，如析抗原表位过程复杂，分抗原抗体结合条件、酶解条件、酶解片段大小、解离后的片段能否有效分离等因素容易对分析结果产生影响。

分子生物学技术的技术缺陷在于其要求对蛋白质抗原的氨基酸序列或者其基因序列较为清楚，需要不断合成表达新的蛋白来验证，工作量大。

噬菌体表达肽库法需要利用基因工程技术进行多轮构建噬菌体，技术、设备要求高，工作量大、耗时长。而且，表达肽库技术筛选的抗原表位为模拟表位(minotope)，其有可能与实际抗原的氨基酸序列差距很大；其只有模拟表位与抗原氨基酸序列高度同源或者相似度很高，并且其三维构象或者在抗原分子三维结构中的位置一致时才可以称作抗原表位。此外，需要考虑的一点是，表达肽库法受肽库容量大小的限制；一般表达的肽段长度为6到8个氨基酸。

现有技术中对于预测法分析蛋白抗原B细胞表位效率不高，预测准确度一般小于50％。

X射线晶体衍射需要大量高纯度蛋白质形成的晶体；而现有技术中还无法对所有蛋白质进行分离纯化，其中部分蛋白质无法获得有效的结晶，抗原抗体复合物也被证明较难形成结晶。而且，X射线晶体衍射需要特殊仪器设备，成本较高。

NMR(核磁共振)技术对样品的需要量大且不能分析分子量很大的复合物(大于40kD)。另外，需要特殊仪器设备，成本较高。

因此，为了解决上述的技术缺陷，开发一种简单、可行的HBV特异性B细胞线性表位测定方法，对于HBV特异性T细胞免疫应答方面的研究，以及乙型肝炎病毒的防治与治疗，都具有极为重要的研究价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种HBV特异性B细胞表位的检测方法；

本发明的另一目的在于提供上述检测方法在HBV特异性B细胞表位肽库筛选与构建中的应用；

本发明的另一目的在于提供上述的检测方法在HBV诊断中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种HBV特异性B细胞表位的检测方法，该检测方法包括如下步骤：