[发明专利]改良的Csy4序列、改良方法及应用

权利要求书

1.一种改良的Csy4序列，其特征在于，是在Csy4序列起始密码子的5’端增加了Kozak序列，Kozak的碱基序列为：gccgccacc；在Kozak序列的5’端增加了β-globin 5’ mRNA序列，β-globin 5’ mRNA的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；改良的Csy4序列的碱基序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种Csy4序列的改良方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）根据密码子的偏好性、GC含量、mRNA二级结构及顺势作用元件，对Csy4序列进行优化改良；

（2）在改良的Csy4碱基序列的起始密码子的5’端增加了Kozak序列：gccgccacc，同时，为了增加mRNA的稳定性，在Kozak序列5’端增加了β-globin 5’mRNA序列，优化后的Csy4称之为GKCsy4，GKCsy4的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

（3）方便载体构建，在GKCsy4序列两端分别添加ClaI和AvaI酶切位点。

3.一种如权利要求1所述的改良的Csy4序列在斑马鱼多基因敲除中的应用，其特征在于，所述改良的Csy4序列为GKCsy4。

4.如权利要求3所述的改良的Csy4序列在斑马鱼多基因敲除中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

（1）GKCsy4序列的合成；

（2）pCS2-GKCsy4载体的构建：使用ClaI和AvaI DNA内切酶分别双酶切pCS2质粒和两侧带有ClaI和AvaI酶切位点的GKCsy4序列，反应条件，37℃、2小时，割胶回收后，利用T4 DNA连接酶连接酶切后的pCS2骨架和GKCsy4序列，获得pCS2-GKCsy4表达载体，即CMV-GKCsy4-polyA表达载体；

（3）针对斑马鱼dnd基因靶序列的设计及DgRNA序列合成：针对斑马鱼dnd基因进行敲除位点的设计，分别在第一外显子和第二外显子上各设计一个靶位点，两个靶位点相距199bp,第一外显子上的靶位点序列为 Ccagcagcaggagcttcagc，称为位点1，第二外显子上的靶位点序列为 Ctctgcaggaatggatgcag，称为位点2，包含位点1和位点2的gRNA称之为DgRNA，其中DgRNA序列如SEQ ID NO.12所示，并将DgRNA序列体外转录；

（4）体外转录获得Cas9 mRNA：利用Cas9质粒，合成Cas9 mRNA；

（5）Cas9 mRNA和DgRNA及pCS2-GKCsy4质粒载体显微共注射，然后对已经显微共注射后的胚胎进行GFP-nanos3’UTR mRNA的二次注射，注射后斑马鱼胚胎，养殖48h开始观察PGCs的数量变化。