[发明专利]一种热稳定性逆转录酶突变体及其应用

说明书

本发明公开一种热稳定性逆转录酶突变体及其应用，所述MMLV逆转录酶突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸，与SEQ ID NO.2具有80％同一性且具MMLV逆转录酶功能和热稳定性增强的蛋白。本发明所述的突变体，活性与母本相当，但热稳定性有显著提高，耐热能力可达到65℃，60℃下反应的活力可以是37℃的1.5倍；在50℃下保温5h，残余活力超过60％，热稳定性比相应母本提高至少4倍。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的突变型MMLV逆转录酶及其制备方法和应用。

背景技术

逆转录酶[EC 2.7.7.49]来源于含RNA的逆转录病毒，在结构上是单体(例如莫洛尼鼠白血病病毒，Moloney Murine Leukemia virus,MMLV)或异二聚体(例如禽骨髓成纤维细胞病毒，Avian Myeloblastosis Virus，AMV)逆转录酶。逆转录酶是一种具有三种酶活性的多功能酶，包括RNA和DNA依赖性的DNA聚合活性，以及催化RNA-DNA杂合链中RNA裂解的RNase H活性。MMLV逆转录酶被广泛用于许多研究应用中，包括cDNA克隆，逆转录酶-PCR定量，微阵列分析，RACE等。MMLV逆转录酶的RNase H活性限制了合成长cDNA的效率。通过开发出RNase H活性降低，且完整保留了RNA依赖性DNA聚合酶活性的突变体(H^-MMLV逆转录酶)，克服了这个问题，同时对于全长cDNA的合成有了很大改善，热稳定性也有了一定的提高(Gerard G.F.,Potter R.J.,Smith M.D.,Rosenthal K.,Dhariwal G.,Lee J.andChatterjee D.K.The role of template-primer in protection of reversetranscriptase from thermal inactivation.Nucleic Acids Res.,2002,30,3118–3129.)。逆转录反应的一个主要问题是单链RNA容易自身配对形成发夹等二级结构，该结构会阻止cDNA合成，导致cDNA分子被截断，这个问题可以通过在较高温度下进行cDNA合成来克服，但野生型逆转录酶的热稳定性较差，在高温条件下会失去活性，进一步改造以提高逆转录酶的热稳定性就十分有必要，H^-MMLV逆转录酶热稳定性虽有一定的提高，但还不足以完全克服热稳定性问题。

现有技术多使用改造的热稳定性提高的逆转录酶。通常MMLV逆转录酶的反应温度为37℃(H^-MMLV逆转录酶为42℃)，升高温度(如55℃)则更利于解开RNA二级结构，从而改善有问题序列的转录，但是这对酶的热稳定性就提出了更高的要求。在较高的非PCR温度(最高55-65℃)下进行逆转录，使用禽类逆转录酶(例如AMV逆转录酶)，和使用稳定剂增强MMLV逆转录酶的热活性。尽管AMV逆转录酶在高温下保留的DNA合成活性比MMLV逆转录酶(最适温度为45-50℃；最高60℃)高，但AMV逆转录酶的逆转录产量(cDNA转化效率)显着低于MMLV逆转录酶(AMV为2％，而MMLV为44％)(Yasukawa,K.,Nemoto,D.and Inouye,K.Comparisonof the thermal stabilities of reverse transcriptases from avian myelo-blastosis virus and Moloney murine leukaemia virus.J.Biochem.,2008,143,261–268.)，同时由于MMLV逆转录酶为单体结构，相比较而言更加简单，因此使用MMLV逆转录酶仍是市场的主流方向。