[发明专利]抗根癌病的靶基因片段及其干扰载体和应用

说明书

本发明公开了抗根癌病的靶基因片段及其干扰载体和应用。本发明通过病毒诱导的基因沉默技术将18段樱桃根瘤病菌的iaaM、iaaH和ipt的靶标片段及其基因融合靶标片段导入樱桃砧木‘ZY‑1’中，发现导入18段靶基因片段的樱桃砧木的抗病性都显著提高，其中有5段靶标片段的抗病性极显著提高，达到高抗水平以上甚至免疫；本发明进一步将这5段靶基因序列构建稳定遗传干扰载体转化樱桃砧木，发现转基因樱桃植物对根癌土壤杆菌抗病性显著增强，达到高抗水平以上。应用本发明所提供的抗根癌病的靶基因片段能够提高果树对根癌病的抗性或进一步培育获得抗根癌病的果树新种质。

技术领域

本发明涉及抗根癌病的靶基因片段，本发明进一步涉及含有这些靶基因片段的干扰载体以及在提高果树对根癌土壤杆菌抗性中的应用，属于抗根癌病的靶基因片段及其应用领域。

背景技术

欧洲甜樱桃(Prunus avium.L)属于蔷薇科，李亚科，樱属果树植物，是目前北方落叶果树中栽培效益最好的树种之一，也是中国北方春季上市最早的鲜果。目前中国的甜樱桃栽培面积和产量已达世界第一。尽管中国甜樱桃产业取得可喜的成绩，但生产中仍存在许多问题，如樱桃根癌病等问题，严重威胁着中国樱桃产业(张开春.等中国甜樱桃的栽培历史、生产现状及发展建议.落叶果树,2017,49(06):1-5.)。

樱桃根癌病，又称冠瘿病，是由根癌土壤杆菌属(Agrobacterium spp.)中的致病菌引起的一种细菌性病害，可侵染多种高等植物(马德钦等.果树根癌病及其生物防治.中国果树,1995,2(5):42-44.)。根癌土壤杆菌可从植株伤口侵入，有寄主组织存在的情况下，细菌并不进入寄主植物细胞，只是把Ti质粒的T-DNA片段导入植物细胞基因组中，在T-DNA上包含数个诱发肿瘤的关键基因，如生长素合成中关键酶色氨酸单加氧酶基因(iaaM)、吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)以及细胞分裂素合成过程中的关键酶异戊烯基转移酶基因(ipt)等，若细胞分裂素和生长素过量表达，使被侵染转化植株的细胞内源激素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限增殖，转化为肿瘤状态，引起癌变，干扰了树体正常养分和水分供应，导致树体衰弱或死亡。由于该病发病率高、传播速度快，严重时可导致全园感病，对中国樱桃产业造成严重的危害(Gohlke J,Deeken R.Plant responses to Agrobacteriumtumefaciens and crown gall development.Frontiers in Plant Science,2014,5:155.)。因此，对威胁樱桃产业发展的根癌病进行深入研究和有效地防治势在必行。选用抗病品种或砧木以及提高砧木的抗病性是防治樱桃根癌病的一个重要途径，而抗病品种或砧木的选育周期长，因此，利用生物技术等手段提高已有砧木品种的抗病性是一种快速而有效的手段。

寄主诱导的基因沉默(HIGS)是在病毒诱导的基因沉默(VIGS)的基础上发展起来，也是转录后基因沉默(PTGS)-RNA沉默的一种表现(Baulcombe DC.VIGS,HIGS and FIGS:small RNA silencing in the interactions of viruses or filamentous organismswith their plant hosts.Current Opinion in Plant Biology,2015,141-146.)。将病原菌的特定基因通过病毒载体或含有双启动子的目的基因片段反义发夹结构载体转染到寄主植物中，导致病原物产生特定序列的双链RNA(dsRNA)。当病原物攻击表达HIGS结构的寄主时，病原菌中的目的基因会下调，亦即通过RNAi结构对在寄主植物中的病原菌内源性基因的表达进行干扰，最终沉默植物病原菌的基因(Nunes and Dean,2012；Yin andHulbert,2018)。HIGS作为一种快速简便、通用性强、靶向性高的新技术克服了以前基因功能研究方法的不足，将在植物专性寄生菌基因功能研究中显示出其强大的优势(肖瑶等.寄主诱导的基因沉默技术研究和应用进展.植物保护学报,2020,47(01):11-17.)。