[发明专利]转化辅助用质粒和使用其的转化物的制造方法以及转化方法

权利要求书

1.一种转化物的制造方法，具有：

将具有用于导入至基因组上的规定位置的目的基因的1种或多种线状基因组导入核酸片段和具有用于组入该线状基因组导入核酸片段的一对同源重组序列的转化辅助用质粒导入宿主的工序；

筛选上述目的基因组入上述宿主基因组中的上述规定位置、表达上述目的基因的转化物的工序，

其中在上述线状基因组导入核酸片段组入转化辅助用质粒的状态下在上述目的基因外侧配置用于在基因组的规定位置进行同源重组的一对同源重组序列和在该一对同源重组序列外侧配置一对核酸内切酶靶序列。

2.根据权利要求1所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有与上述线状基因组导入核酸片段中的目的基因外侧同源重组的一对同源重组序列和在介由该同源重组序列而组入上述线状基因组导入核酸片段的位置的相反侧配置的一对核酸内切酶靶序列。

3.根据权利要求1所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述线状基因组导入核酸片段在夹着上述目的基因的位置具有用于组入上述基因组的规定位置的上述一对同源重组序列、在该一对同源重组序列外侧具有上述一对核酸内切酶靶序列、并且在该一对核酸内切酶靶序列外侧具有用于与上述转化辅助用质粒同源重组的上述一对同源重组序列。

4.根据权利要求1所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有可表达的特异性切割上述核酸内切酶靶序列的双链的靶特异性核酸内切酶基因。

5.根据权利要求4所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述靶特异性核酸内切酶基因为归巢核酸内切酶基因。

6.根据权利要求5所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述核酸内切酶靶序列为归巢核酸内切酶特异性识别的序列。

7.根据权利要求4所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有控制上述靶特异性核酸内切酶基因的表达的诱导型启动子。

8.根据权利要求1所述的转化物的制造方法，其特征在于，上述多种线状基因组导入核酸片段由第1线状基因组导入核酸片段至第n线状基因组导入核酸片段组成，第m线状基因组导入核酸片段3’末端侧具有与第m+1线状基因组导入核酸片段5’末端侧同源重组的序列，其中，n为2以上的整数，m为满足1≤m≤n－1的整数。

9.一种转化方法，其特征在于，具有：将具有用于导入至基因组上的规定位置的目的基因的1种或多种线状基因组导入核酸片段和具有用于组入该线状基因组导入核酸片段的一对同源重组序列的转化辅助用质粒导入宿主的工序，

其中在上述线状基因组导入核酸片段组入转化辅助用质粒的状态下在上述目的基因外侧配置用于在基因组的规定位置进行同源重组的一对同源重组序列和在该一对同源重组序列外侧配置一对核酸内切酶靶序列，

上述目的基因是表达的。

10.根据权利要求9所述的转化方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有与上述线状基因组导入核酸片段中的目的基因外侧同源重组的一对同源重组序列和配置在介由该同源重组序列组入上述线状基因组导入核酸片段的位置的相反侧的一对核酸内切酶靶序列。

11.根据权利要求9所述的转化方法，其特征在于，上述线状基因组导入核酸片段在夹着上述目的基因的位置具有用于组入上述基因组的规定位置的上述一对同源重组序列、在该一对同源重组序列外侧具有上述一对核酸内切酶靶序列、并且在该一对核酸内切酶靶序列外侧具有用于与上述转化辅助用质粒同源重组的上述一对同源重组序列。

12.根据权利要求9所述的转化方法，其特征在于，上述转化辅助用质粒具有可表达的特异性切割上述核酸内切酶靶序列的双链的靶特异性核酸内切酶基因。