[发明专利]一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法

权利要求书

1.一种炔基树脂的制备方法，其特征在于，将炔基肽段与醛基树脂通过还原烷基化反应连接，合成炔基树脂；

所述炔基肽段为GLAGLLAR(aPra)，其氨基酸序列为GLAGLLAR- (L-Pra-NH₂)。

2.根据权利要求1所述炔基树脂的制备方法，其特征在于，所述醛基树脂选自商品化醛基树脂Thermo-AminoLink® Coupling Resin。

3.根据权利要求1所述炔基树脂的制备方法，其特征在于，炔基树脂的制备方法具体包括以下步骤：

炔基肽段与醛基树脂的耦联：炔基肽段、醛基树脂、耦联试剂、还原试剂在室温反应，然后用洗涤试剂洗涤多次；

封闭剩余活性基团：加终止试剂，室温反应；

洗涤炔基树脂：洗涤多次，得到炔基树脂，保存备用。

4.根据权利要求3所述炔基树脂的制备方法，其特征在于，所述耦联试剂选自含有0.1M Na₃PO₄，0.15 M NaCl，pH 7.2的PBS；

所述还原试剂选自终浓度为50 mM NaCNBH₃；

所述终止试剂选自1M Trist-HCl，pH7.4；

所述洗涤试剂为1M NaCl；

所述炔基肽段、醛基树脂、耦联试剂、还原试剂、终止试剂的比例关系为：5 ~20ug：10uL：200uL：20uL：200uL。

5.根据权利要求1-4中任一项所述制备方法获得的炔基树脂。

6.一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、用AHA标记细胞，提取全蛋白；

步骤2、取细胞全蛋白和如权利要求5所述炔基树脂通过click反应连接；

步骤3、用不同的缓冲液洗涤炔基树脂非特异吸附的蛋白质，以除去非特异性吸附的蛋白质；

步骤4、用胰蛋白酶酶切释放目标肽段；

步骤5、收集样品进行质谱分析。

7.根据权利要求6所述一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法，其特征在于，用AHA标记细胞即获得叠氮标记的蛋白样品，获得叠氮标记的蛋白样品的方法为：

先将待检测细胞在不含有甲硫氨酸的培养基中加入透析型血清，进行饥饿培养30min；

然后，换成AHA标记培养基，加入透析型血清，继续培养细胞，收细胞，其中，AHA标记培养基为将甲硫氨酸缺失的培养基中加入1mM的叠氮丙氨酸；

加入细胞裂解液，超声裂解，离心取上清；BAC试剂盒定量蛋白质，-80℃保存备用。

8.根据权利要求6所述一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法，其特征在于，细胞全蛋白和炔基树脂通过click反应连接的方法为铜催化生物正交反应，反应条件为：细胞全蛋白和炔基树脂混合后加入催化混合液，加PBS，放暗处在室温振荡反应。

9.根据权利要求8所述一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法，其特征在于，细胞全蛋白、炔基树脂、催化混合液、PBS加入量为500 µg~2 mg ：10 µL ：2µL ：8µL。

10.根据权利要求8所述一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法，其特征在于，所述催化混合液由抗坏血酸、BTTP、硫酸铜组成，抗坏血酸、BTTP、硫酸铜以摩尔比为10：6：1。

11.根据权利要求6所述一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法，其特征在于，用不同的缓冲液洗涤炔基树脂上非特异吸附的蛋白的方法为：用SDS，尿素和乙腈，依次洗涤，洗涤液浓度为：1% SDS，8M尿素，50%乙腈/水。