[发明专利]一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂及试剂盒和培养方法

权利要求书

1.一种双抗体联合胸腺肽体外培养NK细胞试剂，包括，主要成分为CD161、CD137和IL-2的诱导液，主要成分为IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的活化液，主要成分为IL-2、IL-21的扩增液。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述诱导液中，CD161、CD137、胸腺肽和IL-2的有效浓度范围分别为500ng/ml～1500ng/ml、100ng/ml～1000ng/ml、100～500ug/ml、50IU/ml～500IU/ml。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述诱导液中，CD161、CD137、胸腺肽和IL-2的有效浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、300ug/ml、100IU/ml。

4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、10IU/m～200IU/ml、1IU/ml～50IU/ml和1IU/ml～50IU/ml。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述活化液中，IL-2、IL-12、IL-7、IL-15的浓度分别为400IU/ml、50IU/ml、10IU/ml和20IU/ml。

6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述扩增液中，IL-2、IL-21的有效浓度范围分别为100IU/ml～1000IU/ml、50IU/ml～200IU/ml。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述扩增液中，IL-2、IL-21的浓度分别为500IU/ml、100IU/ml。

8.一种利用权利要求1-7中任意一项所述试剂的试剂盒，主要由诱导液1ml、活化液1ml、扩增液1ml组成。

9.一种利用权利要求1-7中任意一项所述试剂培养NK细胞的培养方法，包括下列步骤：

(1)制备PBMC：使用肝素钠抗凝采血管采集人外周血20ml-30ml，并依次分离血浆和单个核细胞，血浆56℃30min灭活处理离心备用；

(2)制备INDM诱导培养基：吸取1ml诱导液加入19ml ALyS505NK-AC培养基内配制成INDM诱导培养基；单个核细胞用20ml含10％自体灭活血浆的INDM诱导培养基吹打均匀，使细胞密度范围为1.3-1.5×10⁶个/ml，装入悬浮细胞培养瓶静置于37℃5％CO₂培养箱培养；

(3)制备ACTM活化培养基：吸取0.5ml活化液加入180ml ALyS505NK-AC培养基内配制成ACTM活化培养基；Day2补加活化液0.5ml，Day3补加40ml ACTM和Day5补加140ml ACTM，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml；

(4)制备EXPM扩增培养基：吸取1ml扩增液加入2LALyS505NK-EX内配制成EXPM；Day7转到细胞培养袋扩大培养，每两天补加含EXPM扩增培养基，使细胞密度维持5-7×10⁵个/ml，静置于37℃5％CO₂培养箱培养；

(5)培养Day14收获细胞，计数并进行检测，其中，利用CD3⁺CD56⁺进行表型检测。