[发明专利]鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法

权利要求书

1.一种鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤，

步骤一，样品处理，称取待检测鱼粉4g，溶于100ml去离子水中，用玻璃棒搅拌5-8min后静置30min，取上清液，离心沉淀，得到沉淀物；

步骤二，DNA提取，提取沉淀物的DNA；

步骤三，PCR扩增，将沉淀物的DNA进行PCR扩增，其中正向引物GAPDH-F：5′-CACTGCTGCCCTCTTCCTC-3′，反向引物GAPDH-R：5′-ATCCACATCGCAACTTCAT-3′，得到PCR扩增产物；

步骤四，电泳检测，制备含有琼脂糖的凝胶成型器，插入成型梳，加入溴化乙锭，加入PCR扩增产物，电源，调压至4-5V/cm，电泳30min，拍照，根据照片判断鱼粉中是否存在家禽组织。

2.根据权利要求1所述的鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法，其特征在于，步骤二中，提取沉淀物的DNA包括以下步骤，

A，取0.5mg沉淀物放入1.5ml的灭菌离心管中，加入200ul缓冲液GA后进行裂解；

B，向步骤A处理过的离心管中加入20ul Proteinase K溶液，混匀，56℃消化过夜；

C，向步骤B处理过的离心管中加入200ul缓冲液GB，颠倒摇混合1min，70℃放置10 min，至溶液变清亮，离心以去除离心管内壁的水珠；

D，向步骤C处理过的离心管中加入200ul无水乙醇，振荡混合15s，离心管中出现絮状沉淀，离心以去除离心管内壁的水珠；

E，将步骤D处理过的物料转入吸附柱CB3中，12000 rpm离心30 s，倒掉废液；

F，向步骤E处理过的吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000 rpm离心30 s，倒掉废液；

G，向步骤F处理过的吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000 rpm离心30 s，倒掉废液；

H，将步骤G处理过的吸附柱CB3室温放置，至漂洗液被晾干；

J，将步骤H处理过的吸附柱CB3转入离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12000 rpm离心2 min，得到含有DNA的溶液；

K，将步骤J获得的含有DNA的溶液通过DNA 试剂盒提取，得到沉淀物的DNA。

3.根据权利要求1所述的鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法，其特征在于，步骤三中，将沉淀物的DNA进行PCR扩增包括以下步骤，

a，向13.5ul PCR反应混合物中加入1ul沉淀物的DNA、正向引物0.5ul、反向引物0.5ul、双蒸水9.5ul，得到25ul的PCR扩增反应体系；

b，在94℃条件下预变性3min；

c，在94℃条件下变性30s；

d，在60℃条件下退火30s；

e，在72℃条件下延伸20s；

f，35个循环后，在72℃条件下延伸10min，4℃条件下保存备用。

4.根据权利要求1所述的鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法，其特征在于，步骤四中，电泳检测包括以下步骤，

Ⅰ，准备凝胶成型器，插入成型梳；

Ⅱ，将1.5g琼脂糖加至100 mL 1×TAE缓冲液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，加入5ul溴化乙锭至熔化的琼脂糖液中混匀，冷却至60℃以下；

Ⅲ，将冷却的琼脂糖倒入凝胶成型器，制备凝胶，待凝胶变硬且呈不透明乳白色，取出成型梳；

Ⅳ，将凝胶置于电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm；

Ⅴ，取2ul的6X载样缓冲液于封口膜上，再加入5ul PCR扩增产物，混匀后加入点样孔；

Ⅵ，通电，调节电压至4-5 V/cm，电泳30min，断电，把电泳凝胶放到凝胶成像系统中拍照保存；

Ⅶ，观察照片，判断鱼粉中是否存在家禽组织。