[发明专利]产油微生物耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的方法

说明书

本发明属于微生物合成领域，具体而言，涉及产油微生物耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的方法及应用。本发明利用同源重组技术在耶氏解脂酵母Po1f中进行4‑香豆酸‑辅酶A连接酶（4‑CL来源于拟南芥）和二苯乙烯合成酶（STS来源于葡萄）的表达，重组菌株Polf‑At4CL‑VvSTS在添加对香豆酸的YPD培养基中白藜芦醇含量与对照菌Polf相比变化较大，在表达菌株4号中获得674μg/L的白藜芦醇含量。

技术领域

本发明属于微生物合成领域，具体而言，涉及产油微生物耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的方法及应用。本发明利用同源重组技术在耶氏解脂酵母Po1f中进行4-香豆酸-辅酶A连接酶（4-CL来源于拟南芥）和二苯乙烯合成酶（STS来源于葡萄）的表达，并添加外源对香豆酸进行发酵，从而构建能够产白藜芦醇的耶氏解脂酵母细胞工厂。

背景技术

白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素,可在葡萄叶及葡萄皮中合成，是葡萄酒和葡萄汁中的生物活性成分。目前天然白藜芦醇的主要植物来源是虎杖（Polygonumcuspidatum）和葡萄（Vitis）。白藜芦醇是有益于人类健康的非黄酮类多酚化合物，天然植物中提取的白藜芦醇不能满足人们的需求，因此，科研工作者们一直致力于研究出快速、安全的化学、生物合成方法来生产白藜芦醇。

随着耶氏解脂酵母基因组信息的公布和遗传操作工具的完善，研究者们可以在分子生物学水平上对耶氏解脂酵母进行研究。白藜芦醇的合成需要三分子丙二酰辅酶A和一分子对香豆酸辅酶A。耶氏解脂酵母是产油酵母，富含乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，能够提供白藜芦醇合成所需的前体物质丙二酰辅酶A。而白藜芦醇合成另外一个重要前体物质对香豆酸辅酶A则可以在耶氏解脂酵母中通过外源加入对香豆酸并在转入的4-香豆酸-辅酶A连接酶（4-CL来源于拟南芥）催化下合成。最后，在耶氏解脂酵母中三分子丙二酰辅酶A和一分子对香豆酸辅酶A在二苯乙烯合成酶（STS来源于葡萄）的作用下合成白藜芦醇。

发明内容

本发明提供了一种能够产生白藜芦醇的生物方法和产生白藜芦醇的耶氏解脂酵母菌株。

本发明的内容包括：将分别来源于拟南芥和葡萄的4-CL、STS基因克隆形成的重组表达载体pCRCyl-At4CL-VvSTS及表达4-CL、STS基因的重组耶氏解脂酵母菌株，还有产生白藜芦醇的方法。

本发明的重组酵母菌株是将4-CL、STS基因制备重组质粒，并导入耶氏解脂酵母形成。

本发明优选为：根据来源于拟南芥和葡萄的4-CL、STS基因，设计引物将其克隆到单拷贝质粒pCRCylm，形成重组质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS。

具体地，将质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS经限制性内切酶Not I酶切后回收转化耶氏解脂酵母Polf。经过同源重组后得到重组酵母菌株Polf-At4CL-VvSTS。

本发明的另一方面，重组菌株经培养后检测，酵母细胞能够在外源添加对香豆酸的条件下产生白藜芦醇，最高白藜芦醇含量(Polf-At4CL-VvSTS)为674 μg/L。

附图说明

图1重组质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS。

图2 酶切质粒图。

图3耶氏解脂酵母重组菌株PCR

具体实施方式

实施例1：重组质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS的构建。

来源于拟南芥和葡萄的4-CL、STS基因具有完整的基因组序列，这部分由公司代为合成，得到重组质粒pCRCyl-At4CL-VvSTS，如图1所示。