[发明专利]一种促脑胶质瘤耐药的gaMSCs亚群的检测方法

权利要求书

1.一种促脑胶质瘤耐药的gaMSCs亚群的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：收集并分离得到脑胶质瘤相关间充质干细胞（gaMSCs）、人胶质瘤细胞系U87和胶质瘤原代细胞（GBM-1）；

S2：分别制备由DMEM 培养基和脑胶质瘤相关间充质干细胞（gaMSCs）条件培养液培养的人胶质瘤细胞系U87和胶质瘤原代细胞（GBM-1），即得到DMEM 培养基培养的人胶质瘤细胞系U87（Control-U87）、DMEM 培养基培养的胶质瘤原代细胞（Control-GBM1）、脑胶质瘤相关间充质干细胞条件培养液培养的人胶质瘤细胞系U87（gaMSC-U87）和脑胶质瘤相关间充质干细胞条件培养液培养的胶质瘤原代细胞（gaMSC-GBM1）；

S3：将Control-U87、Control-GBM1、gaMSC-U87和gaMSC-GBM1进行胶质瘤化疗药物体外加药处理，得到多个待测样品；

S4：通过CCK-8进行加药待测样品增殖能力的检测分析比对；

S5：通过流式分析技术检测加药待测样品中细胞凋亡情况的分析比对；

S6：通过划痕实验对加药待测样品中的迁移能力进行分析比对；

S7：通过基因芯片分析gaMSCs对脑胶质瘤细胞基因表达的影响；

S8：通过PCR和Western-blot分析FOXS1的表达情况；

S9：通过慢病毒转染获得敲低或过表达FOXS1情况下，检测上皮间质转化（EMT）标记物的变化情况；

S10：通过脑胶质瘤细胞建立裸鼠原位模型并体内给予胶质瘤化疗药物体，进行动物体内加药实验；

S11：通过免疫组织化学检测S10中动物体内肿瘤组织中Ki-67的表达变化；

S12：通过ELISA分析了gaMSCs的IL-6表达分泌情况；

S13：分析比对上述实验检测结果，进行耐药性评价。

2.如权利要求1所述的一种促脑胶质瘤耐药的gaMSCs亚群的检测方法，其特征在于：所述胶质瘤化疗药物体为替莫唑胺（TMZ）。

3.如权利要求2所述的一种促脑胶质瘤耐药的gaMSCs亚群的检测方法，其特征在于：所述替莫唑胺的体外加样浓度为190-210uM（umol/L），体内注射浓度为45-55mg/kg。

4.如权利要求1所述的一种促脑胶质瘤耐药的gaMSCs亚群的检测方法，其特征在于：所述胶质瘤原代细胞选择收集第三代传代细胞进行实验和检测。

5.如权利要求1所述的一种促脑胶质瘤耐药的gaMSCs亚群的检测方法，其特征在于：所述脑胶质瘤相关间充质干细胞需进行CD90高表达和CD90低表达分选。

6.如权利要求5所述的一种促脑胶质瘤耐药的gaMSCs亚群的检测方法，其特征在于：所述脑胶质瘤相关间充质干细胞的分选步骤包括：

S101：培养箱中取出脑胶质瘤相关间充质干细胞置于超净台中，PBS冲洗后用Accutase消化，1500rpm，离心6分钟；

S102：弃上清，1:4加入CD90磁珠抗体和分选Buffer，冲混均匀；

S103：放4℃冰箱避光反应15分钟；

S104：取出细胞，分选Buffer冲洗，1500rpm，离心6分钟；

S105：弃上清，加500ul分选Buffer重悬；

S106：将细胞悬液滴入分选柱，然后滴入2ml分选Buffer洗柱子，滤下的细胞悬液中即为CD90低表达的脑胶质瘤相关间充质干细胞（CD90^-）；

S107：待上述过滤完，再在分选柱中加入2ml含20%血清的DMEM培养基，然后用手柄快速把培养基推出，此时滤下的即为CD90高表达脑胶质瘤相关间充质干细胞（CD90⁺）；

S108：分别将上述CD90^-和CD90⁺细胞转移至培养瓶中，于37℃，5%CO₂培养箱中培养。