[发明专利]系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台和应用

说明书

本发明涉及系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台和应用，特别是涉及一种基于高分辨率熔解曲线（HRM）法的系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台，所述试剂包括SEQ ID No.2上游引物5'‑GAAATGAAAGTAAGGAAGTTAGGAG‑3'和SEQ ID No.3下游引物5'‑AAATCCAATACTATCACTCCATTCC‑3'。本发明通过采用特定的引物，配合高分辨率熔解曲线（HRM）法检测平台，使得检测过程更加简便，易于临床推广应用。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台，特别是涉及一种基于高分辨率熔解曲线（HRM）法的系统性红斑狼疮的诊断试剂及其平台。

背景技术

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种多器官、多系统受累的自身免疫性疾病。临床表现为肾脏、神经精神系统、血液系统等多器官受损。如果能够在SLE患者出现重要器官受累前进行早期诊断对于SLE的防治、改善患者的生活质量、提高患者生存率具有重大意义。然而，目前的生物学诊断标志物大多是在器官受损后出现的生化和免疫学改变，无法对SLE患者器官受累进行早期诊断。

近年来，表观遗传学标记物研究发展迅速，许多表观遗传标志物如DNA甲基化标记物、血清microRNA标记物被筛选和鉴定，这些标记物对于疾病的早期诊断和预后判断具有重要价值。己有大量文献证实DNA低甲基化在SLE患者CD4+T细胞异常活化及SLE发生发展中发挥重要的作用。目前，已经鉴定的在SLE患者CD4+T细胞中发生低甲基化的基因包括CDlla、CD70、CD40L和Perforin等。这些基因的低甲基化导致其过度表达，从而诱导T细胞自身反应性活化，导致SLE发生。其中CDlla和CD70基因启动子调控序列的甲基化已经被证明可以用于SLE的辅助诊断。然而，这种方法限制在检测外周血CD4+T细胞基因组中的CDlla和CD70基因甲基化水平。这就要求我们首先要收集较多的患者外周血样本（约20ml左右），然后利用密度梯度离心法和免疫磁珠分边法分离外周血中的CD4+T细胞。由于抽取患者血液样本较多，患者的医从性较低：而且CD4+T细胞分边的实验成本较高、实验耗时较长，增加了患者的负担。另外，检测CDlla和CD70基因甲基化以往采用克隆测序法、自制芯片法，耗时较长，且无法给出一个精确的甲基化定量水平，给临床上推广应用带来了困难。

在本申请人的授权专利CN105316404B中，已经发现一种用于系统性红斑狼疮早期诊断的生物标记物，其特征在于该生物标记物为位于人IFI44L基因转录起始位点上游1500bp内的一段DNA序列，该段DNA序列位于人类基因组1号染色体79,085,190-79,085,311段，其所包含的两个CG位点的低甲基化水平指示所述系统性红斑狼疮的存在，DNA序列如SEQ NO.1所示。

SEQNO.1：AATCCGCTGTCACTCCACAGACAGACCGAAATACGGATGGCCCTGATGACACCGTGTTCTCGACTTCCTTGCTTTCATTTCATGTCAGTTTAAACTGATTTGCTAGCA。

但是，在该授权专利中，实验步骤包括：（1）抽提受试者外周血全基因组DNA；（2）测定抽提的基因组DNA浓度；（3）亚硫酸盐处理基因组DNA；（4）特异性PCR引物扩增SEQ IDNO.1所示的待测DNA片段；（5）电泳检测PCR产物；（6）对PCR产物进行测序；（7）分析测序结果，获得待测序列中包含的两个CG位点的甲基化水平。

由此可见，上述授权专利的步骤过于复杂，不适用与广泛的临床推广应用。

发明内容

基于上述背景技术，本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测步骤简单，并且更适合临床使用的检测试剂以及检测平台。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：