[发明专利]一种高渗透压诱导细胞凋亡制备囊泡的方法

说明书

本发明提供一种高渗溶液诱导细胞凋亡制备囊泡的方法，以及用所述囊泡包裹化疗药物制备载药囊泡。高渗溶液的渗透压为500‑650mOSM/kg，优选地由海藻糖配制。本发明获得的囊泡数量和粒径均一性均优于紫外光照射诱导产生的囊泡。由高渗透溶液诱导产生的囊泡制备的载药囊泡对体外肿瘤细胞的杀伤作用令人满意。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高渗透压诱导细胞凋亡制备囊泡的方法。

背景技术

细胞骨架是真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，细胞在受到外源性或内源性刺激之后会引起细胞骨架发生重排，导致细胞膜局部受力不均匀。受力异常的胞质会向胞外膨胀，进而随机包裹部分细胞内容物后以囊泡的形式释放到细胞外部。这种直径约为0.1-1μm的特殊亚细胞结构称为“细胞囊泡”。

中国专利CN102302784B及其衍生专利公开了使用紫外线照射肿瘤细胞获得的细胞囊泡与化疗药的在室温条件下进行孵育肿瘤化疗药物制剂的方法。该方法制备的载药囊泡具有毒性低、靶向性强等特点，可以有效的激活机体免疫应答。该制剂是以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡为载体，用其包裹肿瘤化疗药制备而成。该制剂直接到达肿瘤部位，提高了化疗药的药效，同时克服了因外源载体给药而对机体产生的毒副作用。所述肿瘤化疗药物制剂的一种制备方法可以通过紫外光照射诱导细胞凋亡并收集细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与作为有效成分的化疗药物进行孵育，使化疗药被细胞囊泡包裹，形成药物制剂。

但是紫外线穿透力不强，当细胞密度较高时会发生堆积，堆积在里面的细胞不能被紫外线照射到，而只有表层的细胞能够被照射产生囊泡。这给囊泡制备的批次稳定性带来很大挑战。而采用低密度的细胞进行照射，虽然照射均匀，但又会限制囊泡的产能。在肿瘤化疗药物的囊泡制剂领域，亟待开发其他的新型制备方法，以提高效率。

发明内容

本发明提供一种通过配制高渗溶液来诱导细胞凋亡产生囊泡的方法，进而将所述囊泡包裹肿瘤化疗药物制备载药囊泡作为肿瘤化疗药物制剂。渗透压易于通过渗透压调节剂的浓度来进行调节，细胞以搅拌的方式均匀悬浮于高渗溶液中进行诱导，产生的囊泡均匀性良好，便于稳定的大批量制备。本发明所用到的渗透压调节剂均为药典收录的药用辅料，安全性良好。

根据本发明的一个方面，研究了高渗溶液诱导肿瘤细胞产生囊泡的方法。将氯化钠、海藻糖、蔗糖、麦芽糖及D-山梨醇配制的高渗溶液将细胞悬浮于上述高渗溶液中制备细胞囊泡；经过检测诱导产生的囊泡数量和粒径，发现在高渗溶液诱导产生的细胞囊泡与紫外光照射诱导产生的囊泡相比，粒径较为均一，产率也较高。其中，所述高渗溶液优选的，由海藻糖溶解于纯化水配制。

本发明还研究了不同渗透压对诱导细胞凋亡产生囊泡的影响。当高渗溶液的渗透压为500～650mOSM/kg时，细胞的凋亡率和囊泡的产率最高，优选地，诱导细胞凋亡的高渗溶液的渗透压为550mOSM/kg。

本发明还研究了诱导时间对囊泡产率的影响，高渗溶液诱导的细胞囊泡产量随诱导时间增加而上升，超过24h后，产量增加趋缓，优选地诱导时间为24h。

本发明研究了高渗溶液诱导产生的细胞囊泡的功能与紫外光照射产生的囊泡的比较，结果表明两种方式诱导的囊泡对中性粒细胞的趋化作用没有明显差异。

本发明的另一方面，提供一种将高渗溶液诱导产生的细胞囊泡与化疗药物孵育制备载药囊泡的方法，所述载药囊泡包裹的药物为肿瘤化疗药物，选自甲氨蝶呤，阿霉素，顺铂，紫杉醇，5-氟尿嘧啶，吉西他滨或10-羟基喜树碱；优选地，所述载药囊泡包裹的药物为甲氨蝶呤。

本发明研究了通过高渗溶液诱导产生的细胞囊泡制备的载药囊泡的产率以及载药量，与已经公开的紫外光照射诱导和化疗药物诱导制备的载药囊泡相比，本发明载药囊泡的产率和载药量明显提高。本发明还通过实验验证肿瘤细胞对上述三种方式制备的囊泡的摄取效果对比以及体外对A549人肺腺癌细胞系、