[发明专利]利用RNA核酸适配体构建植物新型转化报告系统

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及利用RNA核酸适配体构建植物新型转化报告系统。利用生物信息学方法设计一系列新的核酸适配体，通过体外转录和荧光成像，筛选到一批荧光强度高且稳定性好的RNA核酸适配体。将它们分别融合靶基因转化大肠杆菌进行原核表达，通过激光共聚焦成像筛选出适用于活体细胞成像的候选适配体。随后，构建适配体融合靶基因的表达载体，利用瞬时转化方法将所述表达载体导入烟草叶片，利用激光共聚焦成像分析鉴定可用于植物细胞RNA成像的适配体上，最终利用适配体融合靶基因得到稳定的转基因株系。利用适配体/DFHBI‑1T进行RNA水平转基因鉴定，结合分子鉴定表征了所述报告系统的效率。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种利用RNA核酸适配体构建植物新型转化报告系统的方法。本发明首次设计成功可应用于植物活细胞RNA成像的RNA核酸适配体，并利用该RNA核酸适配体首次构建RNA水平的植物遗传转化报告系统。本发明对于植物基因工程将产生重要的推动作用。

背景技术

基因工程是功能基因组学研究、分子遗传改良和生物医学研究的核心手段。在植物基因工程中，标记基因是有效获得阳性转化植株的关键元件。目前，植物基因工程广泛应用的标记基因包括选择标记基因和报告基因两类。选择标记基因通过赋予植物对有害物质的抗性进而筛选转化子，但该类标记的使用可能对生态系统和人类健康产生潜在危机(Puchta,2000)。与选择标记基因不同，报告基因则是通过表达蛋白产物来报告转化事件及辅助转基因筛选(Miki and McHugh,2004)。目前，植物遗传工程中所使用的报告基因，如GUS和GFP等，存在一些固有缺陷，一方面，转基因植株再生过程中靶基因逃逸事件时常发生(Jiang et al.,2008)，报告基因的表达无法真正反映靶基因在受体细胞的存在和表达；另一方面，报告基因依赖蛋白产物发挥筛选作用，因而导致外源蛋白在受体细胞中大量积累，干扰植物内源基因正常表达(Page and Angell,2002)，影响植物的生理和代谢(Karlowskiand Hirsch,2003)，同时也带来一些食品安全性方面的担忧(Kuiper et al.,2001)。此外，蛋白依赖型报告系统无法应用于非编码RNA的表征研究中。因此，构建不依赖蛋白产物的新型报告系统非常必要。

RNA作为转录环节的关键产物，是表征基因在受体中存在与表达的重要产物之一。近年来对各类RNA生物学作用的研究成为分子生物学研究热点，尤其是对mRNA行为研究备受关注(Xia et al.,2018；Yang et al.,2019)。同时，RNA易降解，细胞内存在周期短。因此，构建RNA水平报告系统具有重要的优势和应用前景。本发明旨在构建可以在植物细胞RNA成像中稳定高效发挥功能的RNA标记，并建立RNA水平新型遗传转化报告系统。这种报告系统不仅可以突破已有报告系统的应用限制；还能够在RNA水平进行动态报告示踪，为植物RNA行为、功能研究提供更为精准的鉴定手段。