[发明专利]一种高效的爬行动物来源的凝血酶及其应用

说明书

本发明公开了一种爬行动物来源的凝血酶，采用基因克隆方法获取多疣壁虎凝血酶原2(Prethrombin‑2)的序列；构建Prethrombin‑2真核表达重组质粒，转染293T细胞，诱导表达Prethrombin‑2重组蛋白并纯化；利用锯鳞蝰蛇毒(Ecarin)激活Prethrombin‑2重组蛋白，得到具有凝血酶活性的壁虎凝血酶(Gecko Thrombin,gTM)。本发明所述的凝血酶在弱碱性(pH8.0)和37℃的条件下，活性最高，Kcat/Km为13475.41M^‑1S^‑1；在pH中性条件下，壁虎凝血酶活性显著高于人的凝血酶活性，提示壁虎凝血酶有望成为一种高效的止血剂，特别是为中枢神经快速止血提供潜在的靶向药物。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高效的爬行动物来源的凝血酶及其应用。

背景技术

凝血酶(Thrombin)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶，由凝血因子Xa裂解其前体凝血酶原后形成，是凝血级联反应中的关键酶。凝血酶除了发挥止血功能外，还对神经细胞产生多种影响。由于凝血酶在止血与凝血、组织修复等方面起到极大的作用,已成为国内外研究的焦点。

目前市售的凝血酶制品中大部分来源于人或牛血浆，考虑到使用牛源性凝血酶存在传播疯牛病病毒的风险性，人们对重组人凝血酶进行了研究。

凝血酶原2(Prethrombin-2)是α凝血酶(α-thrombin)的前体，由凝血酶原(Prothrombin)切除N端的271个氨基酸产生(不包括N-端43个氨基酸信号肽)。凝血酶原2断开其Arg320-Ile321之间的肽键，形成A亚基和B亚基。B亚基由蛋白链和N-糖链组成。A、B两亚基通过二硫键连接组成凝血酶，B亚基含有凝血酶的活性功能区，A亚基对凝血酶的活性起稳定作用。Hiroshi等人公开了一种大规模的生产重组人基因型凝血酶的生产系统，以重组Ecarin激活的凝血酶原-2制备高产量的凝血酶。该重组凝血酶与血浆来源的人凝血酶(野生型)活性相似，可用于替代临床人或牛血浆中提取的酶-凝血酶。(Preparation ofRecombinant α-Thrombin:High-Level Expression of Recombinant HumanPrethrombin-2 and Its Activation by Recombinant Ecarin.J.Biochem.135,577–582(2004))。

自然界中一些低等脊椎动物如两栖类和鱼类具有附肢损伤后可以快速止血并再生相应的组织器官的特点。研究低等脊椎动物的凝血酶的特征及其功能，对开发新的具有止血功能的药物具有一定的意义。

发明内容

本发明以爬行动物壁虎作为研究对象，克隆了多疣壁虎凝血酶原(Prothrombin)的cDNA序列，该序列开放阅读框编码621氨基酸序列(XP_015262498)。本发明对多疣壁虎、人以及小鼠凝血酶原氨基酸序列进行同源比对分析，推测多疣壁虎Prothrombin存在三个切割位点，分别是205-206的Thrombin切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-1)、316-317的Xa因子切割位点(产生凝血酶中间体Prethrombin-2)和364-365的Xa因子切割位点(产生凝血酶中间体Meizthrombin)。将317-621的氨基酸序列定义为Prethrombin-2，以此为模板，设计引物扩增相应的核苷酸序列，构建了Prethrombin-2真核表达质粒，通过转染293T细胞，诱导表达、纯化得到重组蛋白Prethrombin-2。经Ecarin剪切激活，得到酶活力明显高于重组人凝血酶的高效凝血酶(最高可达3.63倍，4℃，pH7.0)。

本发明技术方案如下

一种凝血酶原或其片段，来源于爬行动物，具有产生凝血酶原Prethrombin-1的切割位点、产生凝血酶原Prethrombin-2的切割位点和产生凝血酶原Meizthrombin的切割位点中的一种、两种或三种。