[发明专利]用于五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒检测的引物探针组合、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用于建立同时检测黄热病毒(YFV)、拉沙病毒(LASV)、汉坦病毒(HTV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)及登革热病毒(DENV)的极速检测引物探针组合、试剂盒及其应用。本发明具备很高的灵敏度和特异性，其建立的方法与其他荧光定量PCR相比，可在半小时内获得结果，可达到临床快速检测，有望实现真正的POCT，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及用于五种重要节肢/啮齿媒介传播病毒检测的引物探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术

通过近年来我国对新发突发传染病，尤其是严重急性呼吸道综合征(severeacute respiratory syndrome，SARS)、甲型H1N1流感、输入型埃博拉、中东MERS、寨卡等的防控经验表明，快速诊断在病毒性传染病的预防和控制中发挥着越来越重要的作用。这些诊断试剂从方法学上讲，主要分为两大类，即免疫学诊断和分子诊断。免疫学诊断技术一般是以抗原抗体特异性反应为基础的检测技术，主要包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫层析技术以及最近发展的以化学发光法、时间分辨荧光分析法等为代表的新型检测技术。而分子诊断则是病毒核酸为对象的病原快速检测技术，早期的分子诊断技术是采用核酸杂交技术对目的核酸进行检测，而随着分子生物学的发展，多种扩增放大技术被应用于临床诊断中。将低拷贝的靶序列成对数级放大扩增，同时采用比放射性探针更灵敏的非放射性检测系统(如电化学发光系统、实时荧光系统等)，大大提高了核酸检测的敏感性，并减少了放射性物质的使用。这其中的代表技术是以荧光系统为代表的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR)。该方法具有的诸多优点如快速准确、髙通量、高敏感性，模板污染可能性低，不需要再进行电泳检测等都为它的推广奠定了基础，现在已经广泛应用于医学诊断、出入境检疫、基础研究，特别是医学和分子生物学等研究领域。

而传统的荧光定量PCR方法尚存在试剂价格高，检测时间长、无法达到真正的即时检验(point-of-care testing,POCT)，不能实现便携、可移动及现场快检的要求。而微流控芯片技术作为近年来新用于检测的新型技术，可以弥补以上不足。该技术的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。探针和靶分子的作用是主动式的，因而大大增强敏感性，提高反应速率。针对病原微生物基因组的特征性片段、染色体DNA的序列多态型、基因变异的位点及特征等，设计和选择合适的核酸探针，经PCR扩增后检测，就能获得病原微生物种属、亚型、毒力、抗药、致病、同源性、多态型、变异和表达等信息，为疾病的诊断和治疗提供一个很好的切入点。

登革病毒(Dengue virus,DENV)是有囊膜的正链RNA病毒，通过虫媒传播，属于黄病毒科黄热病毒属。共分为DENV1-4共4个血清型，每种血清型又存在多种基因型。自上世纪五十年代，登革热在全球范围广泛蔓延，每年新增病例约为3900万，全球化进程也加快了该病的流行进程。登革热病毒直径为50nm，成熟病毒粒子含有衣壳蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E三个结构蛋白，多个C蛋白包裹病毒基因组RNA形成病毒核衣壳。依赖患者年龄、状态等不同因素，病程表现存在差异。但大多数临床感染均呈现发热症状，称为登革热。严重疾病状态会出现毛细血管通透性增加的特征，进而导致血浆渗漏，从而导致血流动力障碍和登革休克综合征(DSS)。如果不治疗，严重疾病可能导致个体死亡率提高至20％，但经专业及时的处置和液体替代治疗，死亡率可以降低到不到1％，因此，做到快速准确对登革热病毒实现早诊断、早发现、早治疗十分关键。