[发明专利]一种两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物及其应用方法在审
| 申请号： | 202010542347.4 | 申请日： | 2020-06-15 |
| 公开（公告）号： | CN111549146A | 公开（公告）日： | 2020-08-18 |
| 发明（设计）人： | 张靖雯;杨江华;张效伟 | 申请（专利权）人： | 南京易基诺环保科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6869;C12N15/11 |
| 代理公司： | 江苏瑞途律师事务所 32346 | 代理人： | 王琳琳;陈彬 |
| 地址： | 211106 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 两栖动物 线粒体 通用 条形码 扩增 引物 及其 应用 方法 | ||
1.一种两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物，其特征在于：包括至少一条上游引物和一条下游引物组合的引物对，
所述的上游引物序列包括：
Am312-F1：TAGAGGAGCCTGTNCTATAATCGAT；
Am246-F2：CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT；
Am250-F3：ACGAGAAGACCCNATGGAGCTT；
所述的下游引物序列包括：
Am312-R1：GAAGAGGGNGACGGGCGGTGTGT；
Am246-R2：AAGCTCCATNGGGTCTTCTCGT；
Am250-R3.1：CGCTGTTATCCCNAGGGTAACTTG；
Am305-R3.2：ATCCAACATCGAGGTCGTAAACC；
Am387-R3.3：CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGG。
2.根据权利要求1所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物，其特征在于：所述上游引物和下游引物对组合包括以下几种方式：(1)Am312-F1与Am312-R1组合；(2)Am246-F2与Am246-R2组合，(3)Am250-F3与Am250-R3.1组合，(4)Am250-F3与Am250-R3.2组合，(5)Am250-F3与Am250-R3.3组合。
3.权利要求1～2任意一项所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)DNA样本的提取；
(2)目的片段的扩增：对步骤(1)中的DNA样本进行PCR扩增，其中，PCR扩增引物采用至少一条所述上游引物和至少一条所述下游引物组合成的引物对；
(3)针对步骤(2)中扩增产物的片段大小分析，或对步骤(2)中的扩增产物进行高通量测序。
4.根据权利要求3所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述上游引物与所述下游引物组合的摩尔比为1：(1～3)。
5.根据权利要求4所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述引物对进行PCR反应的退火温度约为55℃左右。
6.根据权利要求5所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述DNA样本包括环境源DNA样本及生物源DNA样本。
7.根据权利要求6所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中待扩增的DNA样本浓度为0.1ng/μL以上。
8.根据权利要求5或6所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，扩增反应体系的体积为30μL，反应体系中包含以下物质：2μL的10μM的上述引物，所述的上游引物和下游引物体积各1μL；12μL的去离子水；15μL的Taq MasterMix；1μL的DNA样本。
9.根据权利要求4所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物的应用方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述上游引物与所述下游引物组合的摩尔比为1：1。
10.权利要求1～2任意一项所述的两栖动物线粒体通用宏条形码扩增引物在两栖动物物种鉴定、两栖动物多样性、系统发育关系、系统地理学或遗传多样性分析中的应用。
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