[发明专利]一种重组SPAM1蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种重组SPAM1蛋白及其应用，属于医学技术领域。所述重组SPAM1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的重组SPAM1蛋白具有较高的降解透明质酸的酶活力。与不含有GPI修饰结构域SPAM1‑W相比，加入含有GPI锚修饰结构域的SPAM1重组蛋白后，精子胞内钙信号明显提高且其顶体反应发生率显著增加。完整SPAM1蛋白的成功制备将更有效的提高体外受精作用，提高其临床应用度，为男性不育的治疗提供有效的手段。

技术领域

本发明属于医学技术领域，具体涉及一种重组SPAM1蛋白及其应用。

背景技术

特异性人精子黏附分子（SPAM1）是通过羧基末端的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定至精子头部浆膜和顶体内膜，但不跨越膜磷脂双层的单链膜蛋白，即人透明质酸酶PH-20。SPAM1的509个氨基酸序列主要由三部分组成：信号肽（1-35氨基酸）、SPAM1结构区（36-483氨基酸）及GPI锚修饰结构域（484-509氨基酸）。GPI修饰锚是真核生物翻译后修饰所产生，主要由磷酸氨基乙醇联结子、核心聚糖和糖脂链组成，其中在聚糖核心的磷酸肌醇、葡萄糖胺甘露醇残基可以被磷酸氨基乙醇组和其他糖类不同程度的修饰，这种复杂的结构具有编码细胞膜表面上不同功能的能力。GPI锚定蛋白SPAM1的生理功能具有多样性，如：发挥位于头部浆膜透明质酸酶中性活性和顶体内膜酶酸性、中性活性，有效降解卵细胞周质；识别并结合透明带，促进精卵结合；作为透明质酸受体，调节Ca²⁺信号而介导精子顶体胞吐作用。

近年来，针对SPAM1的特异酶活性，科研人员将检测SPAM1的透明质酸酶活性的高低作为预测人类精子受精潜能的重要指标。虽然研究表明无GPI锚修饰结构区的重组SPAM1已被成功体外表达并应用于体外受精（IVF）和胞浆内单精子注射（ICSI）技术，也可用于解决大分子药物难以渗透肿瘤细胞外基质的问题中，但该重组蛋白缺乏因 GPI 结合肽段（484-509 氨基酸区域），限制了 SPAM1 进行更好的临床应用。

现有研究表明不育男性精子SPAM1活性与精子密度、活力、形态及精卵结合等因素密切相关，精子顶体内透明质酸含量及活性的降低是导致男性不育的重要原因之一，检测透明质酸活性可作为临床评价精子功能的有效指标。因此，完整的SPAM1蛋白的成功制备将有助于深入理解受精过程，并为男性不育的诊断与治疗提供新策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组SPAM1蛋白，该重组SPAM1蛋白含有GPI修饰结构域，具有较高的降解透明质酸的酶活力，可用于治疗弱精症。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种重组SPAM1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码所述重组SPAM1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

上述重组SPAM1蛋白的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，利用Hind III/Xho I双酶切位点将SEQ ID NO:2所示序列插入至表达载体pcDNA3.1(+)中，获得C端含有His标签的重组质粒；

步骤2，将重组质粒转染至293T细胞进行表达，并对获得的蛋白进行纯化，得到重组SPAM1蛋白。

上述重组SPAM1蛋白在制备男性不育治疗药物中的应用。

上述重组SPAM1蛋白在制备男性不育诊断药物/试剂中的应用。

本发明通过体外重组并优化纯化条件获得含有GPI修饰结构域的SPAM1蛋白，该重组蛋白具有较高的降解透明质酸的酶活力。与不含有GPI修饰结构域SPAM1-W相比，加入含有GPI锚修饰结构域的SPAM1重组蛋白后，精子胞内钙信号明显提高且其顶体反应发生率显著增加。完整SPAM1蛋白的成功制备将更有效的提高体外受精作用，提高其临床应用度，为男性不育的治疗提供有效的手段。

附图说明