[发明专利]一种编辑绵羊FGF5基因实现选择性剪接的sgRNA、成套核酸分子和应用

说明书

本发明提供了一种编辑绵羊FGF5基因实现选择性剪接的sgRNA、成套核酸分子和应用，属于细胞工程和基因工程技术领域，所述sgRNA由如SEQ ID No.1～6所示的核苷酸序列退火得到；所述SEQ ID No.1和SEQ ID No.2两两退火；所述SEQ ID No.3和SEQ ID No.4两两退火；所述SEQ ID No.5和SEQ ID No.6两两退火。本发明提供的sgRNA能够实现对绵羊FGF5基因选择性剪接的编辑。

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，尤其涉及一种编辑绵羊FGF5基因实现选择性剪接的sgRNA、成套核酸分子和应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。该基因编辑技术系统主要由Cas9核酸酶和sgRNA组成。Cas9核酸酶具有切割双链DNA的活性结构域，使得双链DNA断裂；sgRNA是由起支架功能的tracrRNA与特异性的crRNA结合形成的嵌合RNA。sgRNA通过RNA-DNA碱基互补配对将Cas9/sgRNA复合物靶向募集到目的基因，Cas9再通过识别目的基因上的PAM基序(5’-NGG-3’)定点切割双链DNA，进而对目的基因起到编辑作用。

CRISPR/Cas9慢病毒系统(Lentiviral CRISPR/Cas)可以感染多种哺乳动物细胞，该系统可以共同表达一种哺乳动物编码优化的Cas9核酸酶和sgRNA，以促进基因组编辑。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效的整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。

慢病毒载体构建原理：慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。收集到的细胞上清可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

FGF5基因属于成纤维细胞生长因子FGFs(一类调节细胞生长的多功能肽类生长因子)家族成员之一，其被认为在毛发生长过程中抑制了毛发的生长期，而这一功能可以被FGF5变位剪接体方式产生的截短型FGF5(FGF5s)所调控，并可解除FGF5对毛发生长的抑制作用。截短型FGF5(FGF5s)是FGF5 mRNA在成熟过程中发生选择性剪接的产物。选择性剪接(也叫可变剪接)是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体的过程，使得最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。已有研究发现，从大鼠、小鼠和人脑组织中可分离出两种FGF5亚型。其中一种亚型为FGF5全长mRNA，包含3个外显子；另一亚型为截短型FGF5(FGF5s)，即FGF5全长mRNA序列中的外显子2通过变位剪接体方式被切除。但是现有技术还未有关于利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对绵羊FGF5基因进行选择性剪接的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种编辑绵羊FGF5基因实现选择性剪接的sgRNA、成套核酸分子和应用，本发明提供的sgRNA能够实现对绵羊FGF5基因进行选择性剪接的编辑。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：