[发明专利]一种鉴定药物靶蛋白的方法

说明书

本发明提供一种鉴定药物靶蛋白的方法，其具体步骤包括：以细胞为样品，加入细胞裂解液，采用液氮反复冻融法获得细胞中的蛋白质组样品；将上述所得蛋白质组样品平均分为两份，其中一份加入一定体积一定浓度的药物母液而得到实验组样品，另一份加入等量的DMSO而得到对照组样品；使用含金属离子(Mⁿ⁺)的盐溶液分别对实验组和对照组样品进行处理，获得一系列具有Mⁿ⁺终浓度梯度的实验组和对照组样品，离心分离得到上清液和沉淀部分；对上述步骤中得到的上清液样品或沉淀部分样品进行蛋白质定量检测分析；和，对上述步骤中的测定数据进行分析评价，绘制各个蛋白质的溶解度曲线，实验组和对照组的溶解度曲线有显著性差异的蛋白质即为鉴定到的药物靶蛋白。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定药物靶蛋白的方法。

背景技术

准确识别药物的靶蛋白、揭示药物的作用和脱靶机制可以为新型药物的研发提供关键信息，为药物在临床应用中可以更好地发挥疗效提供理论支持。

经典的药物靶蛋白鉴定方法主要包括亲和色谱法(Affinity chromatography)和基于活性的探针分析法(Activity-based probe profiling,ABPP)。亲和色谱法是将药物或者具有活性的小分子固载到固体基质上，然后与细胞裂解液进行孵育来捕获与药物或小分子有相互作用的蛋白质。这种方法比较典型的应用是通过固定非选择性激酶抑制剂(kinobeads)进行激酶筛选来构建蛋白质激酶与抑制剂的相互作用网络。基于活性的探针分析原理是合成同时带有反应基团和标签基团的小分子化学探针来对靶蛋白进行识别和鉴定。由于探针与其相互作用蛋白质之间通过共价键结合，因此该方法非常适合那些与药物亲和力很弱的靶蛋白的鉴定。但是这两种方法通常都需要对小分子药物进行化学修饰或者衍生，这可能会导致小分子药物的结构、活性以及其与靶蛋白之间的亲和力发生改变。另外，由于小分子药物的非特异性结合还会造成一些假阳性的鉴定结果。因此，为了减少实验过程中由于药物修饰环节所带来的不良影响，亟需要发展无化学修饰的方法用于药物靶蛋白的鉴定。

近年来，随着生物质谱仪和蛋白质组学技术的快速发展，一些基于蛋白质结构和稳定性变化分析的蛋白质-药物检测策略得到了发展。如Martinez等人在2013年报道的CETSA(Cellular thermal shift assay,CETSA)是一种的体外药物靶蛋白筛选技术，依赖于配体可以稳定蛋白质的原理，通过监测药物结合引起的蛋白质热稳定性变化来确定药物靶蛋白。最近Zhang等人开发了一种溶剂诱导的蛋白沉淀(Solvent-induced proteinprecipitation,SIP)方法在蛋白质组学层面上鉴定药物靶蛋白。该方法基于的概念是与药物结合的蛋白质更不容易被有机溶剂变性沉淀，有助于热稳定性变化不显著的靶蛋白的发现及鉴定。这两种技术的关键都是利用蛋白质变性沉淀的过程，通过对比药物结合前后蛋白质分别在热稳定性和有机溶剂耐受性方面的差异来识别靶蛋白。众所周知，除了加热、有机溶剂可以使蛋白质变性沉淀之外，金属盐也是一类非常有效的蛋白质沉淀剂，因此本发明采用金属离子诱导蛋白质沉淀技术结合蛋白质定量分析策略，发展一种药物靶蛋白鉴定新方法。该方法可在不对药物分子进行任何化学修饰的情况下实现对药物靶蛋白的无歧视性、高灵敏度和高通量鉴定，为药物的作用机理和脱靶机制研究提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定药物靶蛋白的方法，从而为药物作用机制研究和新药研发提供理论依据。

一种鉴定药物靶蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)以细胞为样品，加入细胞裂解液，采用液氮反复冻融法获得细胞中的蛋白质组样品；

(2)分别制备实验组和对照组样品，所述实验组样品为上述步骤获得的蛋白质组样品中加入一定体积一定浓度的药物母液于室温下旋转孵育而获得；所述对照组样品为与实验组等量的上述步骤获得的蛋白质组样品中加入与药物母液等体积的DMSO于室温下旋转孵育而获得；