[发明专利]卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用

说明书

本发明公开了一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂，该添加剂包括铜蓝蛋白。由此，可以显著提高卵母细胞第一极体排出率、显著降低卵母细胞ROS含量，显著提高孤雌激活后胚胎囊胚率，由此可以大大提高卵母细胞的成熟率和质量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用。

背景技术

哺乳动物的体外受精胚胎、克隆胚胎、孤雌胚胎以及转基因胚胎广泛应用于遗传改良、胚胎早期发育机理研究、表观遗传调控等胚胎工程技术领域，卵母细胞体外培养质量是决定胚胎发育的关键因素，但至今卵母细胞体外培养的成熟效率和质量未得到较大的提升。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是影响卵母细胞体外培养的一个重要因素。ROS是生物有氧代谢的一种产物，包括氧离子、超氧离子、羟基自由基和过氧化氢等。在平衡状态下，ROS作为信号分子在激素信号、细胞内氧化还原调节和胚胎发育等生理过程中发挥着有益的作用。然而，体外培养是一个静态的环境，没有营养物质和代谢产物的更换，容易造成ROS的累积，从而改变了它们的功能并损害细胞存活。因此，ROS对卵母细胞的活力、基因表达、蛋白质合成和分子信号传导产生负面影响，影响了卵母细胞的成熟和发育能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用，以解决上述问题。

根据本发明的一个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂，该添加剂包括铜蓝蛋白。由此，可以显著提高卵母细胞第一极体排出率、显著降低卵母细胞ROS含量，显著提高孤雌激活后胚胎囊胚率，由此可以大大提高卵母细胞的成熟率和质量。

在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液添加剂的铜蓝蛋白浓度为1.25-10μg/ml。由此，该浓度范围的铜蓝蛋白添加剂，培养的卵母细胞成熟率更高，质量更好。

在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液添加剂的铜蓝蛋白浓度为2.5μg/ml。由此，添加2.5μg/ml浓度的铜蓝蛋白体外培养的卵母细胞的成熟率最高，质量最好。

根据本发明的另一个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液，该培养液包括铜蓝蛋白；或包括1.25-10μg/ml的铜蓝蛋白；或包括2.5μg/ml的铜蓝蛋白。由此，使用包括铜蓝蛋白/或1.25-10μg/ml的铜蓝蛋白/或2.5μg/ml的铜蓝蛋白的卵母细胞体外成熟培养液，可以大大提高卵母细胞体外成熟率和体外成熟质量。

在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液包括：基础液、0.6mM半胱氨酸、0.91mM丙酮酸钠、10ng/mL表皮生长因子、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％卵泡液、10IU/mL孕马血清促性腺激素和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素、铜蓝蛋白。由此，该培养液，可以大大提高卵母细胞体外成熟率和体外成熟质量。

在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液包括：基础液、0.6mM半胱氨酸、0.91mM丙酮酸钠、10ng/mL表皮生长因子、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％卵泡液、10IU/mL孕马血清促性腺激素和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素、1.25-10μg/ml铜蓝蛋白。由此，该培养液，可以大大提高卵母细胞体外成熟率和体外成熟质量。

在某些实施方式中，卵母细胞体外成熟培养液包括：基础液、0.6mM半胱氨酸、0.91mM丙酮酸钠、10ng/mL表皮生长因子、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％卵泡液、10IU/mL孕马血清促性腺激素和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素、2.5μg/ml铜蓝蛋白。由此，该培养液，对提高卵母细胞体外成熟率和体外成熟质量的效果最佳。

根据本发明的另一个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂在体细胞克隆技术上的应用。由此，可以大大提高卵母细胞的体外成熟率和质量，进而应用在体细胞克隆技术上，可以提高体细胞克隆胚胎的成功率和质量。