[发明专利]抗H5N1病毒入胞抗体PTD-3F-mFc及其应用

说明书

本发明公开了抗H5N1病毒入胞抗体PTD‑3F‑mFc，其碱基序列如序列表SEQID NO.7所示；制备方法为：按照人IgG的Fc基因序列设计突变铰链区半胱氨酸的CH2‑CH3基因序列，并在各组分之间插入相应的内切酶酶切位点以方便后续基因操作，该设计基因序列进行人工合成，合成的基因连接入前期构建的PTS表达载体中，构建PTS‑mFc表达载体；在此基础上再次克隆构建PTS‑PTD‑3F‑mFc表达载体，将构建的表达载体转化入大肠杆菌中，诱导表达并纯化，比较其抗病毒活性，并优选单分子入胞抗体；以及本发明的单分子抗体在制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用；结果表明PTD‑3F‑mFc抗H5N1病毒效价为600TCID50。

技术领域

本发明属于生物工程及重大传染病防治领域，具体涉及抗高致病性禽流感H5N1病毒全人源单分子入胞抗体PTD-3F-mFc的制备，以及制备抗H5N1型人禽流感病毒药物的应用。

背景技术

人感染高致病性禽流感(简称人禽流感)，是由A型流感病毒H5N1引起的全身性或呼吸系统的传染病，病死率达60%以上。自然情况下，流感病毒感染的宿主范围有一定的特异性，据此可将病毒分为不同的群，如人流感、禽流感、猪流感等，但是流感病毒感染宿主范围的界限并不十分严格，病毒可在不同种属间传播。自1997年香港首次报道人感染H5N1亚型禽流感病毒以来，高致病性H5N1禽流感病毒在禽类中持续流行，并不断发生人类感染事件，这就赋予了禽流感全新的公共卫生意义，即高致病性禽流感病毒对人类健康的巨大威胁不仅在于造成当前严重的个体感染甚至死亡，更在于病毒持续变异，可能获得人际传播能力，导致新一轮人类流感的大流行。

在病毒不断产生耐药性的情况下，新型抗体药物可能成为应对H5N1病毒引发潜在流感大流行的有效手段。目前针对人禽流感的治疗以使用抗病毒药物为主，当前批准的抗病毒药物包括两种离子通道抑制剂和两种神经氨酸酶抑制剂，但由于耐药相关位点突变等原因，流感病毒不断产生耐药。如果连续数年对重症及危重症患者超适应症使用抗病毒药物,以及将抗病毒药物作为预防性药物普遍使用,势必不能排除增加耐药的可能性、高风险以及由此导致的公共卫生安全严重后果。在此情况下，制备新型抗流感病毒药物非常必要。抗体对于严重流感的治疗非常有效，但异源抗体免疫原性强，临床应用易引发人体严重的变态反应。随着基因工程技术的发展，基因工程抗体的发展非常迅速，其中单链抗体以其特异性高、分子量小，结构简单，较亲本抗体免疫原性低，在临床应用中能够最大减轻异种蛋白引起的变态反应的独特优势，吸引了众多科研工作者的目光，其制备技术已趋于成熟，特别是噬菌体展示技术更提高了抗体及抗体基因的筛选效率。因此，单链抗体对病毒感染性疾病的治疗将发挥重要的作用。但单链抗体在体内半衰期比较短，一般仅为25-30分钟左右，导致其体内发挥中和病毒作用不彻底，所以必须增加单链抗体的体内稳定性，常用的方法为单链抗体偶联其它生物大分子或基因工程融合表达单链抗体-生物大分子。

H5N1病毒最主要的中和抗体来自于表面糖蛋白血凝素（HA），所以HA成为以往主要研究靶标。然而H5N1病毒具有高度变异性，根据分子进化树分析预测结果显示H5N1病毒HA基因已演变成至少10种不同抗原性特征的变异分支，不同分支之间的免疫交叉反应较弱。鉴于病毒变异的影响，基于保守抗原组分的抗体能够对不同亚型禽流感病毒产生抗病毒作用。流感病毒基质蛋白M1是禽流感病毒主要的结构蛋白，位于病毒囊膜内侧，通过与宿主细胞靶蛋白结合而参与和调控病毒的复制、转录、释放等过程。M1蛋白序列保守，因此针对M1的抗体可以通过与M1蛋白结合，抑制其活性，干扰各亚型禽流感病毒的复制、转录及释放，从而起到广谱抗病毒的作用。