[发明专利]一种软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法和应用

权利要求书

1.一种软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从软枣猕猴桃休眠枝条上剥取休眠芽，放入预培养液中预培养1-5d；

(2)无菌条件下，将休眠芽常温下装载10-60min，于0℃下用玻璃化液处理90-150min，加入少量新鲜的玻璃化液后迅速投入液氮中，冻存；

(3)取出后立即水浴解冻，用MS卸装液洗涤卸装，干燥后转至恢复培养基，暗培养1-3d后置于光下培养。

2.根据权利要求1所述的软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤(1)中，从软枣猕猴桃休眠枝条上剥取休眠芽前，需进行灭菌，具体步骤包括：

将休眠枝条用水冲洗干净后，剪成1-3cm的单芽茎段，先用洗洁精浸泡清洗30min，期间每10min搅动1次，再用水冲洗30min，转移至超净工作台上，单芽茎段先进行剥皮处理，再用体积分数75％酒精浸泡30s进行表面消毒，无菌水冲洗4-5次，之后用0.1％HgCl₂震荡灭菌30min，无菌水冲洗4～5次，即剥取得到休眠芽。

3.根据权利要求1所述的软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预培养液为包含0.3-0.7mol/L蔗糖和/或1-2mol/L甘油的MS液体培养基。

4.根据权利要求1所述的软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤(2)中，所述装载的培养液为MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。

5.根据权利要求1所述的软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤(2)中，所述玻璃化液为PVS₁、PVS₂、PVS₃或PVS₄。

6.根据权利要求5所述的软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤(2)中，所述玻璃化液为PVS₂。

7.根据权利要求1所述的软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤(3)中，所述水浴解冻的水浴温度为38℃。

8.根据权利要求1所述的软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法，其特征在于，步骤(3)中，所述所述MS卸装液含有1.2mol/L蔗糖；所述恢复培养基为含有0.01-0.02mg/LNAA和1-2mg/L6-BA的MS固体培养基。

9.一种权利要求1-8任一项所述的方法在离体保存软枣猕猴桃休眠芽中的应用。