[发明专利]一种PCCI-2U质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种PCCI‑2U质粒及其构建方法和应用，所述的质粒命名为PCCI‑2U，质粒包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、oriV复制子、原核转录终止子T3te和tonB终止子、trp基因和yeast 2μ复制子基因。本发明的提供的一种PCCI‑2U质粒及其构建方法和应用，在大肠杆菌中具有拷贝数低、容量大、稳定性高等特点，在酵母中依赖高拷贝的2μ复制子能稳定复制，具有编码色氨酸的TRP基因，可以利用SC‑rtp半合成培养基进行筛选。本发明的PCCI‑2U可用长基因的酵母内组装，用于长片段基因、结构复杂基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域。

技术领域

本发明属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种能够在单拷贝和中拷贝之间切换、大容量、高稳 定性的酵母-大肠穿梭载体PCCI-2U质粒的构建方法和应用。

背景技术

现代生物学建立以来，从解码一个人的基因组计划的人类基因组计划，到分析人群差异性的HapMap， 再到利用基因组围剿疾病的GWAS以及现在的精准医疗，在基因组巨大的宝藏之中，人类的探索从未停止。 现在科学家已经有能力从头建构或者重编程大肠杆菌或者酵母的基因组。

基因组组装技术基于大规模基因组数据分析,发现新型的或隐藏的生物活性物质合成基因簇。利用基因组 装技术,可提高或激活沉默的生物合成基因簇在微生物中的表达,从而合成潜在的、有价值的生物活性物 质。

TAR(转化重组技术)是利用酿酒酵母体内高效的同源重组系统实现多个具有末端重叠序列的DNA片 段的一步组装方法，它不仅能够方便地将较短的DNA片段组装成较长的DNA片段，甚至还能够实现整个基 因组的组装。2016年3月，测序和合成生物学先驱CraigVenter及其同事们宣布，他们重编码了支原体 细菌的基因组，将其基因组大小从约一百万碱基减少到五十万碱基，使用TAR技术创建了“最小”基因组 ——这是目前维持生命所需的最小基因组。

酵母菌也有质粒存在，这种2pm长的质粒称为2um质粒，约6300bp。这种质粒至少有一段时间存在 于细胞核内染色体以外，利用2um质粒和大肠杆菌中的质粒可以构建成能穿梭于细菌与酵母菌细胞之间的 穿梭质粒。酵母克隆载体都是在这个基础上构建的。应用TAR克隆方法需要将DNA克隆到大肠-酵母穿梭 载体。

人们为了克隆大片段DNA，创造了很多人工染色体载体，例如酵母人工染色体YAC，大肠杆菌人工染 色体BAC。

酵母人工染色体YAC能够用于克隆100-1000kb的基因组，容量远远大于大肠人工染色体BAC载体， YAC载体的主要元件包括端粒序列CEN和自主复制序列ARS，能够确保载体能随着酵母的有丝分裂稳定复 制。YAC载体的主要元件也包括筛选标记基因，例如合成亮氨酸的leu基因，当转化leu基因突变的酵母 菌株，涂布于缺少亮氨酸的培养基SC-LEU时，只有含YAC载体的酵母克隆才能在平板上生长。

大片段DNA的克隆伴随的问题有：常规载体克隆大片段DNA有容量限制，克隆20k以上的基因时往往 出现序列缺失，克隆失败等问题。克隆的DNA基因转录对大肠杆菌有毒性的RNA或编码毒性蛋白时，会导 致大肠杆菌死亡，最终无法获得阳性克隆的质粒。大片段DNA基因存在毒性基因及不稳定基因的概率大于 小片段DNA，因此更难于克隆。常规克隆载体DNA序列包括复制子、抗性基因、多克隆位点序列，载体序 列上的启动子可能会对插入序列进行通读和转录，或插入序列中的启动子可能会发生序列通读，影响载体 元件的基因表达，这也会导致基因的克隆失败。

序列通读会导致外源基因的转录翻译，可能导致外源DNA的克隆失败。序列通读指的是RNA聚合酶结 合启动子序列，持续转录RNA，在终止子位置从DNA上脱落，如果没有终止子序列，RNA聚合酶会在转录 当前基因后继续转录，一直到从DNA上脱落为止。