[发明专利]一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法

权利要求书

1.一种DNA稳定性同位素探针原位揭示河湖底泥中厌氧铁氨氧化细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.原位采集水体底泥样本；

S2.¹³C-、¹⁵N-双标记特异性孵育厌氧铁氨氧化细菌：将底泥样本置于容器中，添加Fe(III)，再添加¹³C-NaHCO₃和¹⁵N-NH₄Cl，并同时添加C₂H₂气体，密封容器；孵育5～6天后，提取土壤DNA；

S3.将步骤S2的土壤DNA通过氯化铯超高速离心分离重层DNA；

S4.对步骤S3浮力密度梯度分层DNA进行标记程度鉴定，对¹³C，¹⁵N-双标记且筛选出的重浮力密度DNA进行高通量测序分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述水体为河流或湖泊。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述底泥样本为预培养后的污泥，具体为将混合均匀的新鲜污泥置于容器中并加水稀释，置换容器中的气体，以制造无氧反应环境，24～26℃避光孵化4～5天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fe(III)的添加浓度为20～25mg-Fe/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述¹³C-NaHCO₃和¹⁵N-NH₄Cl的添加浓度分别为30～35mg-C/L和15～20mg-N/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C₂H₂气体的用量为其所填充的容器体积的30％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2还包括同时以添加¹²C-NaHCO₃和¹⁴N-NH₄Cl，添加¹³C-NaHCO₃和¹⁵N-NH₄Cl的处理分别作为对照。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3具体为将DNA样品与GB缓冲液混合得DNA-GB样品溶液，再分别添加CsCl溶液、GB溶液，调整样品目标折射率为1.4029±0.0002；再18～22℃，180000～200000×g，超高速离心44～46h；离心结束后，用固定流速泵对离心管中的混合液进行分层，用PEG6000和70％乙醇洗涤每层DNA。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述DNA-GB样品溶液、CsCl溶液、GB溶液的体积比为0.1：0.9：4.9。

10.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，步骤S4具体为针对不同浮力密度层级DNA样品，采用通用细菌16s rRNA特异性正向引物1055F和反向引物1392R，通过qPCR扩增各层16s rRNA基因，通过各层基因比较的相对丰度，反映¹³C，¹⁵N-双标记的重层DNA在浮力密度梯度中的分布状况，再针对被¹³C，¹⁵N-双标记且筛选出的重浮力密度DNA进行二代高通量测序分析。