[发明专利]一种德谷胰岛素的制备方法

说明书

本发明提供了一种德谷胰岛素衍生物及其制备方法。具体地，本发明的方法利用包含绿色荧光蛋白折叠单元的德谷胰岛素融合蛋白进行德谷胰岛素的制备，并对Boc修饰的德谷胰岛素主链进行Fmoc修饰，利用正交保护进行德谷胰岛素的侧链加成。本发明还提供该制备方法过程中涉及的Fmoc和Boc修饰的德谷胰岛素主链以及包含德谷胰岛素主链的融合蛋白。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及一种德谷胰岛素的制备方法。

背景技术

糖尿病是全球范围内威胁人类健康的一大疾病。在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加快，糖尿病的患病率呈快速上升趋势。糖尿病的急慢性并发症，尤其是慢性并发症累计多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。

由丹麦诺和诺德公司研制的重组德谷胰岛素注射液“Tresiba”是一种新型的长效胰岛素类似物。2013年1月得到欧盟批准，应用于I型和II型糖尿病患者的治疗。德谷胰岛素其结构特点为通过一个L-γ-Glu连接子将重组人胰岛素(去B链30位苏氨酸)的B链29位赖氨酸侧链εNH₂基与修饰剂16碳脂肪二酸偶联而成。此设计提供一种独特的延长作用时间的机制。该种胰岛素类似物具有作用时间超长、变异性小、能够和速效胰岛素形成复方制剂等优点，皮下注射后会形成六聚体结构，此结构可作为一个存储库缓慢释放德谷胰岛素单体，这些单体能够缓慢并持续的被吸收利用。

国内外关于德谷胰岛素制备的报道很多，一般是通过一种基因重组技术得到德谷胰岛素主链(主链)，再通过液相合成方法连接tBuO-Pal-Glu(OSu)-OtBu物质得到德谷胰岛素，由于德谷胰岛素主链处于未保护的状态，在连接过程中侧链容易接在N末端氨基上，从而产生杂质，导致纯化困难和收率较低的问题，工艺较复杂。

因此，本领域技术人员致力于开发新的、更长效的胰岛素衍生物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种德谷胰岛素的制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种德谷胰岛素前体融合蛋白，从N端到C端具有式III所示的结构：

A-FP-TEV-R-G (III)

式中，

“-”代表肽键；

A为无或前导肽，

FP为绿色荧光蛋白折叠单元，

TEV为第一酶切位点，较佳地为TEV酶酶切位点；

R为用于酶切的精氨酸或赖氨酸；

G为德谷胰岛素或其活性片段；

其中，所述的绿色荧光蛋白折叠单元包含2-6个选自下组的β-折叠单元：