[发明专利]一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用。本发明构建了一套类似试剂盒的通用barcode片段，使得以更低的成本，更快的速度进行基因型鉴定。本发明将barocde与二代测序相结合开发的新型鉴定基因型技术对于SNP和InDel的鉴定是十分高效且简单的，同时所需成本远远低于市面价格，尤其是对大批量样品的鉴定此优点更加突出。另外这种技术也可以应用于基因定位以及绘制遗传图谱等，因此它的应用范围也十分广泛。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用。

背景技术

高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(Next-generationsequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序技术一般由样品准备、文库构建、测序反应和数据分析四部分组成，这就使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。利用高通量测序技术进行SNP分型的方法有：GBS(Genotyping-by-sequencing,通过简化基因组基于二代测序进行基因分型技术)(Elshire et al.2011)、AmpSeq(amplicon sequencing，通过扩增子测序的低成本基因分型技术)(Yang et al.2016)、HD-Marker(基于高通量测序的GoldenGate方法)(Lv etal.2018)等。传统的利用测序技术进行基因分型的方法通常会遭受数据丢失率高和错误率高的困扰，特别是在低读取深度下来自杂合基因座和稀有等位基因的检测会产生较高的错误率，且成本高昂。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用高通量测序进行基因分型的方法、试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本发明的直接目的是非诊断目的地进行基因分型，且仅依据本发明中的检测方法的检测结果无法得出疾病的诊断结果。

本发明是这样实现的，一种利用高通量测序进行基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建通用Barcode片段，包括前引物和后引物，所述前引物中包括bridge片段及Barcode1片段，所述后引物中包括Barcode2片段及reverse primer片段；以黄色荧光蛋白YFP片段DNA为模板，利用所述前引物和后引物进行PCR扩增YFP DNA，得到Barcode片段；

针对待测SNP位点设计一对普通引物，其中前引物距离SNP位点在150bp内或者后引物距离SNP位点在36bp内，且后引物需要在其5’端加上bridge片段；以样品DNA为模板，利用设计的引物进行SNP片段扩增；

将各样品对应的上述扩增的Barcode片段和SNP片段做混合模板，进行overlapping PCR扩增，获得用于测序的完整片段；所用正向引物为SNP位点的前引物，所用反向引物为reverse片段的反向互补序列；

将获得的待测序片段混合后进行纯化；

纯化后的产品建库并进行二代测序；

数据分析，得出基因分型结果。

针对384个待测样本设计24种包含不同Barcode1序列的前引物以及16种包含不同Barcode2序列的后引物；涉及的前引物序列见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.24所示；涉及的16种后引物序列见SEQ ID NO.25-SEQ ID NO.40所示；对待测样本检测时，由前引物和后引物组成不同的引物对。