[发明专利]一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，更具体地，本发明提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法。本发明的第一方面提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法，包括步骤：Pb电极的电化学氧化处理；利用固定化载体进对酶进行固定。本发明提供了一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法，通过对Pb电极的电化学氧化处理以及对特定酶液的固定制备生物电极的方法解决了乳酸氧化酶固定化率低以及固定化材料生物相容性差的问题；实现了乳酸氧化酶生物电极的高效性和可重复性，是一种固定化效率高、生物相容性好的酶固定化技术。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地，本发明提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法。

背景技术

乳酸氧化酶是一种黄素蛋白，以氧作为底物，以FMN和FAD为辅因子,可将乳酸直接转化丙酮酸。FMN和FAD和酶蛋白结合牢固，不需要外源添加辅因子。利用乳酸氧化酶生产丙酮酸是工业上生产丙酮酸的重要手段之一。此外，当人体中出现大量乳酸且无法代谢时，将会出现乳酸酸中毒症状，所以乳酸氧化酶对于乳酸在人体中的检测具有重要的意义。

乳酸氧化酶作为一种常温酶，其稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在检测中更为广泛的应用，所以需要一种优化的固定化方式提高其可利用性。

目前乳酸氧化酶常用的固定化方法有交联法、共价结合法微囊法、网格法、物理吸附法、结晶法、离子结合法等，但在生物电极的应用中一定程度上降低了酶反应活力和阻碍了酶电子传递，所以开发一种优化的乳酸氧化酶的固定化方法是十分必要的。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供一种乳酸氧化酶生物电极的制备方法，包括如下步骤：

(1)Pb电极的电化学氧化处理；

(2)利用固定化载体进对酶进行固定。

作为本发明的一种优选技术方案，Pb电极的电化学氧化处理包括步骤：

A1：Pb电极置于硝酸与重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理；

A2：利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理。

作为本发明的一种优选技术方案，硝酸的质量浓度为8～12％；重铬酸钾的质量浓度为1.5～3.5％。

作为本发明的一种优选技术方案，固定化载体选自戊二醛、壳聚糖、聚赖氨酸、全氟磺酸(Nafion)中的任一种或多种的组合；优选为壳聚糖。

作为本发明的一种优选技术方案，壳聚糖的体积浓度为0.25～1.50％，并置于3～6℃下保存。

作为本发明的一种优选技术方案，利用固定化载体进对酶进行固定的固定方式为：

C1：取酶液滴加滴定至步骤(1)所得电极表面，并于3～6℃下避光放置至干燥；

C2：将固定化载体滴加覆盖滴定在步骤C1所得电极表面，并于3～6℃下避光放置至干燥。

作为本发明的一种优选技术方案，酶液与固定化载体的体积比为1：(0.8～1.2)。

作为本发明的一种优选技术方案，酶液的制备方法包括：

B1：对解耶氏酵母菌进行全基因提取，设计一对引物对目的基因LOX的PCR扩增获得目的基因序列；

B2：利用同源重组的方法，利用一步克隆试剂盒，37℃水浴30min对步骤(1)所得目的基因与出发载体pET-28a(+)连接构建表达载体；

B3：用宿主菌E.coli BL21构建含有LOX基因的基因工程菌E.coli BL21，将构建好的LOX菌株接入LB摇瓶中，34～39℃培养2.5～4.5h，再加入50mM乳糖溶液，18～22℃培养22～26h，表达出乳酸氧化酶基因；