[发明专利]一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明的蔗糖磷酸化酶突变体的热稳定性较野生型有了明显的改善，蔗糖磷酸化酶突变体T219L和I31F/T219L/S360A/T263L在50℃下具有较好的热稳定性，半衰期大约为50min，相比野生型提高了35min左右。

技术领域

本发明涉及一种蔗糖磷酸化酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，SPase)催化蔗糖磷酸解反应生成α-D-葡萄糖-1-磷酸和D-果糖及其可逆反应。该酶具有葡萄糖基转移能力，可以将蔗糖分子的一个葡萄糖基转移至不同的受体上。近年来，利用该酶生产α-熊果苷和α-葡萄糖基甘油(α-glucosyl glycerol,αGG)等精细化学品受到了越来越多的关注。

对于工业应用，为了避免微生物污染，碳水化合物的转化最好在60℃或更高温度下进行。但是大多数SPase并不是嗜热型的酶。现有的SPase热稳定性差，例如，来源于streptococcus mutants的野生型SPase，其在55℃条件下处理20min酶活仅为初始活性的11.3％(具体可见参考文献：Fujii K,Iiboshi M,Yanase M,et al.Enhancing theThermal Stability of Sucrose Phosphorylase from Streptococcus mutans byRandom Mutagenesis[J].Journal of Applied Glycoence,2006,53(2):91-97.)。

因此，急需找到一种热稳定性好的蔗糖磷酸化酶突变体。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体，所述蔗糖磷酸化酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示的蔗糖磷酸化酶相比，第219位氨基酸由苏氨酸突变为了亮氨酸；

或者，所述蔗糖磷酸化酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示的蔗糖磷酸化酶相比，第31位氨基酸由异亮氨酸突变为了苯丙氨酸，第219位氨基酸由苏氨酸突变为了亮氨酸，第360位氨基酸由丝氨酸突变为了丙氨酸，第263位氨基酸由苏氨酸突变为了亮氨酸。

在本发明的一种实施方式中，编码所述蔗糖磷酸化酶突变体的原始酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶来源于肠膜明串珠菌ATCC12291。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-28a质粒。

本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供了产上述蔗糖磷酸化酶突变体的制备方法，所述方法为将1-5％接种量接入到TB液体培养基中，于35-39℃，200-220r/min培养至菌密度OD达到0.5-0.7后，加入IPTG诱导剂于23-27℃，200-220r/min诱导20-30h后收集菌液，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心收集上清，分离上清液中的蔗糖磷酸化酶突变体。

本发明还提供了应用上述方法制备得到的蔗糖磷酸化酶突变体。

本发明还提供了上述蔗糖磷酸化酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法在制备食品、药品、保健品、化妆品中的应用。

[有益效果]