[发明专利]一种ABO基因单倍体分型方法及试剂

说明书

本发明涉及一种ABO基因单倍体分型方法及试剂。所述ABO基因单倍体分型方法包括以下步骤：（1）设计并合成可扩增长片段特定等位基因的PCR扩增引物；（2）制备人基因组DNA；（3）根据ABO基因型，进行选择性PCR反应扩增人基因组DNA中ABO基因单倍体部分DNA序列；（4）将扩增产物进行双酶切纯化；（5）提供寡核苷酸测序引物，将双酶切纯化产物进行测序PCR反应；（6）将测序产物进行醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；（7）确定ABO基因单倍体并指定其基因型。本发明所提供的ABO基因单倍体分型方法可选择性的分离出三个等位基因的单倍体形式，在ABO疑难血型的鉴定、ABO新等位基因序列的确认和精确分型等方面的具有广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种ABO基因单倍体分型方法。本发明还涉及一种用于ABO基因单倍体分型方法的分型试剂。

背景技术

人类ABO血型是最具临床意义的血型系统，对其进行准确分型以明确个体血型基因型具有重要意义。

ABO血型抗原由ABO基因所决定。该基因位于人类9号染色体(9q34.1～34.2)，由A、B和O三个复等位基因控制。目前，A、B和O三个等位基因已报道存在约有400多个包含不同突变的基因形式，且在不断发现新的突变体。由于人类染色体为2倍体形式，因此，个体的ABO血型基因型通常以该三个复等位基因中的单个或两个等位基因组合存在。现有的ABO血型系统基因分型常用技术如PCR-SBT等，通常是对2倍体组成的基因进行扩增测序，杂合子基因获得的基因分型结果通常为2个等位基因的杂合状态。因此，对于存在新的点突变或组合不明确的状况时，现有的分型技术无法明确新突变点所在的等位基因，也无法判断个体的ABO基因型，只能是推测的结果。而解决此类问题只能通过分离单倍体，而获得ABO基因单倍体目前只能通过基因克隆技术来实现两个等位基因的分离。但ABO基因的单克隆技术存在两个主要的问题，第一，DNA克隆基因序列太长，克隆难度较大，而cDNA序列由于ABO基因转录剪接的存在，获得其cDNA序列难度较大。第二，克隆技术本身操作过程极其繁琐，时间跨度长，从克隆到序列鉴定通常需要3-4天的周期，而且克隆过程可引入假性突变，因此，通过传统的克隆技术来获得ABO基因的单倍体目前局限性较大。

因此，建立一种快速有效，且适用性广泛的单倍体分离技术对ABO血型的精准鉴定和科学研究具有重要的意义和实用价值。

发明内容

针对现有ABO基因分型技术的局限性和克隆技术的繁杂性与困难度，对新等位基因的确认和血型的精准诊断带来的困难，本发明目的在于提供了一种ABO基因单倍体分型方法，为ABO基因的单倍体分型提供了一种简单、快速、有效且适用性广泛的技术方法，以实现大部分样本的ABO基因的单倍体序列确认，从而明确新的等位基因点突变或重组等变异，为解决ABO血型标本的鉴定提供一种全新的方法。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种ABO基因单倍体分型方法，其特征在于：所述ABO基因单倍体分型方法对ABO基因第2号外显子至第6或第7号外显子序列进行长片段PCR选择性扩增单倍体等位基因和测序分型，并包括以下步骤：

针对ABO基因单倍体的不同等位基因序列的特异性，设计并合成可扩增长片段特定等位基因的PCR扩增引物，以分离A/B杂合型或B/O杂合型或A/O杂合型人基因组DNA中的A等位基因或者B等位基因或者O等位基因；

表1